Diseño de un ELISA con péptidos sintéticos para el diagnóstico de la Arteritis Viral Equina

METZ, G.E; LORENZÓN, E.N; SERENA, M.S; PANEI, C:J; DIAZ, S; CILLI, E.M; ECHEVERRÍA, M.G

Buenos Aires

Congreso; XIX Reunión Científico Técnica; 2012

IntroducciónEl virus de Arteritis Equina (VAE) pertenece al orden Nidovirales, familia Arteriviridae,género Arterivirus (1). La característica mas relevante de la infección por el VAE esproducir infecciones subclínicas. Sin embargo, de manifestarse la enfermedad, los signosclínicos más importantes son abortos, enfermedad respiratoria en animales adultosy neumonía en potrillos. Tras el brote de la enfermedad en el año 2010, el númerode muestras remitidas al laboratorio para el análisis de AVE aumentó de manera considerableal promedio anual de los años anteriores, llegando a analizar casi 5000muestras en un período de 7 meses. Este aumento en el promedio anual de muestrasrecibidas, puso en evidencia la necesidad de contar con una técnica alternativa a latécnica oficial de Neutralización Viral a fin de complementar y/o reemplazar el costo deesta técnica, complejidad, y en especial, el tiempo de 72 hs requerido para la obtenciónde un resultado. Además, una contaminación o toxicidad asociada a la muestrasupondría una resiembra y la entrega del resultado luego de una semana de ingresadala muestra al laboratorio.El objetivo del trabajo será diseñar un ensayo de ELISA para el VAE utilizando péptidossintéticos.Materiales y MétodosLos dos péptidos empleados fueron una porción de la región V1 de la proteína gP5 -V1gP5 (67-90 aa)- y una porción correspondiente a la región C terminal de la proteínaM -CterM (130-162 aa)-. Ambos péptidos se sintetizaron manualmente por el métododel 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) en fase sólida sobre una resina Rink AmideMBHA de 0,6 mmol/g (Advanced ChemTech). El material sintetizado se purificó medianteCromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) en fase reversa con una columnaC18 en un sistema semipreparativo Beckman System Gold, obteniéndose una purezasuperior al 95%. Finalmente los mismos se caracterizaron por Espectrometría deMasas usando un aparato Shimadzu model LC-10A/C-47A. Cada uno de los péptidospor separado o en conjunto se utilizaron como antígeno en el desarrollo de las pruebasde ELISA. Se pusieron a punto los parámetros de concentración de péptido y diluciónde suero a utilizar así como el tiempo de adsorción de cada uno de los péptidos enplacas Maxisorp (Nunc). Se utilizaron inicialmente 45 sueros pertenecientes al laboratoriode Virología de la FCV-UNLP, previamente caracterizados por la técnica oficial deNeutralización Viral.ResultadosLa concentración óptima de cada uno de los péptidos utilizada fue de 12 μg/ml mientrasque la dilución de los sueros fue de 1/8. En los distintos ensayos de ELISA realizadoscon los péptidos, ya sea juntos o por separado, se obtuvo una mejor correlacióncon los resultados de la neutralización viral empleando el péptido V1gP5. Utilizando unvalor de corte de 0,7, la sensibilidad del ensayo fue del 90%. Si el valor de corte seleccionadofuera 0,6, la sensibilidad aumenta a 95% y con un valor de corte de 0,5, lasensibilidad seria de 100%.Discusión y ConclusionesEl objetivo de este trabajo fue diseñar en ELISA tamiz en base a la utilización de péptidossintéticos como antígeno. Para definir el valor de corte de la prueba se tuvo encuenta la prevalencia del brote de AVE de 2010 (2%) y la correlación de resultadoscon la prueba oficial de Neutralización Viral. Con un valor de corte de 0,7 se logró unalto porcentaje de sensibilidad, lo que permite discernir correctamente los sueros negativos.Con un valor de corte de 0,5 la sensibilidad aumenta a 100% en desmedro dela especificidad. La prueba tamiz por definición, debe ser de fácil aplicación y bajo costoy debe ser altamente sensible, de modo que falle solamente en un número pequeñode animales infectados (3).Cualquier resultado positivo a esta prueba debe someterse a la prueba confirmatoria,por lo tanto la especificidad se tolera reducida. Con la prueba de ELISA desarrolladase logró de esta manera separar las muestras negativas en un menor tiempo que laNeutralización Viral.