Alcances terapéuticos potenciales de la inhibición de la vía NF-kB en una línea celular linfoblastoide humana.

CAVALIERE V; LORENZETTI M; VALVA P; PAPADEMETRIO D; BLANCO G; HAJOS S; PRECIADO MV; ALVAREZ E

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virología

NF-kapaB es un factor de trascripción que regula procesos de muerte/sobrevida en células normales y patológicas. En líneas celulares infectadas con el virus de Epstein Barr (EBV), su activación constituye un mecanismo protector crítico frente a estímulos inductores de apoptosis. Previamente, hemos establecido una línea celular (PL104) con características inmunofenotípicas de linaje linfoide B, a partir de una muestra de médula ósea de una leucemia mieloide aguda. El objetivo de este trabajo fue evaluar la presencia de EBV, determinar los efectos de los inhibidores de NF-kapaB, Ácido Cafein Feniletil éster (CAPE) y MG-132, en la sobrevida de las células PL104 y correlacionar los resultados obtenidos en PL104 con los de una línea celular derivada de un linfoma de Burkitt EBV+ (Raji, ATCC). Las células PL104 se coagularon con solución etanol:formol:acético (80:15:5), se fijaron en formol e incluyeron en parafina. Para detectar la presencia de EBV se realizó hibridación In situ de EBERs (Epstein Barr encoded RNAs) sobre los cortes histológicos y se amplificó por PCR un fragmento de 122pb del genoma viral correspondiente a la región repetitiva BamHI W (IR1) a partir de ADN total celular. Se caracterizó la expresión de los antígenos virales de EBV: EBNA-1(Epstein Barr Nuclear Antigen-1) y LMP-2A (Latent Membrane Protein 2A) por inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales sobre los cortes histológicos. La capacidad inductora de apoptosis de CAPE y MG-132 en PL104 y Raji fue evaluada morfológicamente mediante tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio post tratamiento. Se evaluó por citometría de flujo la exposición de fosfatidilserina en la membrana celular mediante la técnica de Annexin-V FITC/IP. La expresión de IB, p-IB, Survivina, Bcl2 y Bax se determinó mediante Western blot a partir de extractos protéicos citoplasmáticos de las células PL104. La determinación de EBERs reveló localización nuclear en 90% de las células. Se confirmó la presencia de ADN viral por PCR. La caracterización de la expresión de antígenos de EBV en PL104 mostró un patrón de tinción perinuclear para EBNA 1, mientras que para LMP2A se observó una tinción citoplasmática y de membrana, ambas en el 90% de las células. El análisis morfológico de la apoptosis en PL104 resultó en (40.8+2.3)% (p=0.001) para CAPE (50 µg/ml) y (72.9+2.0)% (p=0.001) para MG-132 (2 µM), datos confirmados por Annexin-V FITC/IP. Los dos inhibidores de NF-kapaB modularon tanto la expresión del inhibidor citosólico de NFkapaB (IkapaB y p-IkapaB) como de proteínas antiapoptóticas (Survivina y Bcl2) y proapoptóticas (Bax). El tratamiento de las células Raji, por 24 hs, con CAPE (50 µg/ml) resultó en (40.91±2.33)% de células apoptóticas (p=0.001) y (23.67±3.88)% (p=0.01) de células apoptóticas para MG-132 (2 µM) evaluado por tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio. Nuestros resultados permiten concluir que el EBV se encuentra presente en la línea celular PL104. La inhibición farmacológica de la actividad de NF-κB indujo una significativa muerte celular mediada por una regulación negativa de las proteínas antiapoptóticas y una regulación positiva de la proteína proapoptótica; indicando que la vía NFkapaB es fundamental para la sobrevida de estas células. La línea celular Raji, mostró una susceptibilidad semejante al tratamiento con CAPE aunque menor con MG-132. Los resultados obtenidos respaldan el uso potencial de inhibidores de NF-kapaB en el tratamiento de patologías asociadas a EBV.