Molibdoenzimas involucradas en el metabolismo del nitrógeno en la bacteria Sinorhizobium meliloti 2011

FERRONI F; RIZZI A; BRONDINO C

Salta

Congreso; XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2009

Universidad Nacional de Salta-Asociación Argentina de Fisicoquímica

Resumen extendido:Introducción. El nitrógeno es un elemento básico esencial para la vida debido a que es constituyente de macromoléculas biológicamente relevantes como proteínas y ácidos nucleicos. Las interconversiones de las especies nitrogenadas constituyen el ciclo global biogeoquímico del nitrógeno el cual es sostenido por procesos biológicos en los cuales las bacterias juegan un rol muy importante. En este ciclo se conjugan varias metaloenzimas, entre ellas nitrato reductasas  Mo-dependientes. Las nitrato reductasas tienen roles importantes en las vías asimilativa y desnitrificante de nitratos dado que catalizan el primer paso de dichos procesos. Una buena fuente de nitrato reductasas es Sinorhizobium meliloti 2011, una bacteria fijadora de nitrógeno que es capaz de asimilar nitratos y que además presenta la vía de desnitrificación completa.Objetivos. Optimizar el cultivo de S meliloti 2011 para producir nitrato reductasas. Purificar las muestras enzimáticamente activas y caracterizarlas cinética y espectroscópicamente.Resultados. Se cultivó S meliloti 2011 en medio LB adicionado de Mo, Fe y Cu en fermentadores de 10 L y la inducción de las enzimas se realizó en el cultivo saturado en atmósfera de N2 en presencia de NO3- y NO2-. Se purificaron dos fracciones activas: una citoplasmática con actividad dual nitrato/nitrito reductasa (figura superior) y una membranar con actividad nitrato reductasa (figura inferior). Son diferenciables tanto en composición de subunidades como en propiedades espectroscópicas y cinéticas. Las enzimas aisladas siguen cinéticas de Michaelis-Menten. Se puede deducir la presencia de cofactores hémicos y no hémicos (centros [FeS]) por espectroscopía UV-Vis y reacción con o-dianisidina. CN-, N3- y ClO3- son inhibidores de las enzimas aisladas. La determinación de metales permitió demostrar la existencia  de Mo lo que también se demostró por inactivación con WO42-. No se pudo observar la señal de Mo por EPR.Conclusiones. Al igual que en Bradyrhizobium, no hay genes reportados que codifiquen para una nitrato reductasa membranar tipo NarGHI por lo que las enzimas membranares aisladas de estas rizobacterias podrían formar parte de una nueva familia de nitrato reductasas. Por otro lado, la fracción activa aislada del citoplasma presenta además actividad nitrito reductasa, lo que rara vez se observa en la naturaleza. Trabajo subvencionado por: CONICET, CAI+D UNL y ANPCyT Proyecto N° 00439 PICT 2006 BID 1728 OC/AR y Proyecto N°06 13872 PICT 2003 BID 1728 OC/AR.