Dinámica evolutiva del virus de hepatitis C en niños: contribución de la compartimentación viral en células mononucleares de sangre periférica

GISMONDI, M. I.; BECKER, P.; DIAZ CARRASCO, J. M.; GUZMÁN, C.; CAMPOS, R.; MARIA VICTORIA PRECIADO

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

El virus de hepatitis C (HCV) produce infecciones crónicas que pueden devenir en cirrosis y/o hepatocarcinoma. En niños, la infección crónica por HCV presenta características clínicas distintas que en adultos, sin progresión a cirrosis durante la niñez. El hígado constituye el principal sitio de replicación viral. Se ha demostrado que algunas variantes virales presentan tropismo por células mononucleares de sangre periférica (CMSP), en las cuales ocurriría un bajo nivel de replicación. Este tropismo diferencial se vincula con la existencia de variantes que presentan distintas secuencias primarias en las glucoproteínas de envoltura viral (E1-E2). Dentro de E2, la región hipervariable 1 (HVR1), sometida a presión de selección por el sistema inmune, resulta útil para la descripción de la dinámica de cuasiespecies del HCV durante la infección crónica. El objetivo de este trabajo fue analizar la evolución de esta región en muestras de plasma (P) y estudiar la compatimentación viral en CMSP durante la infección crónica por HCV en niños. Se obtuvieron17 muestras de sangre periférica de 4 casos HCV+ durante un período de seguimiento de 38-51 meses. Se separó el plasma y se aislaron las CMSP por centrifugación sobre Histopaque (Sigma). Se extrajo el ARN total de 17 muestras de P y de 12 muestras de CMSP y se amplificó por RT-PCR anidada un fragmento de 351 pb que contiene a HVR1. Los productos de amplificación se clonaron en un vector pCR2.1 (Invitrogen). Se secuenciaron y analizaron 168 clones de plasma y 110 clones de CMSP. Para cada caso, se reconstruyeron las relaciones filogenéticas entre P y CMSP con las secuencias nucleotídicas (máxima verosimilitud) y se calculó la diversidad intra-muestra y entre muestras para P y CMSP (ClustalX, Modeltest, PAUP*). Se evaluó la evidencia de selección positiva mediante el cociente dN/dS (MEGA). Las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias nucleotídicas se utilizaron para analizar la composición de aminoácidos de HVR1 y la complejidad de cuasiespecies (entropía de Shannon modificada) en cada caso. El análisis estadístico se realizó mediante test no paramétricos (GraphPad InStat). Se detectó ARN viral en todas las muestras de P y CMSP analizadas. En el caso 1 (niña de 13 años, HCV-1b) se evidenció un patrón temporal de evolución de HVR1 en P, con diversidad y complejidad de cuasiespecies crecientes durante 50 meses. Las variantes virales detectadas en CMSP reflejaron la dinámica evolutiva de HVR1 en P. El caso 2 (niña de 2 años, HCV-1a/c) mostró la coexistencia de poblaciones virales distintas que se alternaron en el P durante 38 meses de seguimiento. La complejidad de cuasiespecies aumentó en ese lapso. Estas poblaciones virales se observaron también en CMSP, si bien con menor complejidad, detectándose en algunos casos primero en éstas y luego en P. En el caso 3 (niño de 4 años, HCV-1a/c) se observó un patrón evolutivo ?de a saltos? en las muestras de P, con disminución de la diversidad y complejidad de cuasiespecies durante los 51 meses del seguimiento. Por el contrario, la complejidad se incrementó en CMSP. En el caso 4 (niño de 11 años, HCV-1a/c, tratamiento con interferón alfa durante 7 meses) se evidenció la existencia de al menos 2 grupos de variantes virales resistentes al tratamiento, con 2 patrones diferentes de evolución de HVR1. La complejidad de cuasiespecies en P se incrementó luego del tratamiento. En las CMSP se observó escasa diversidad y complejidad de cuasiespecies, con alternancia de linajes durante el seguimiento. En los 4 casos se detectaron variantes de HVR1 con tropismo diferencial por P o por CMSP, y otras variantes con tropismo dual P-CMSP. En la mayoría de los casos, la diversidad y la complejidad de cuasiespecies resultaron menores en CMPS que en P. Los múltiples patrones de evolución de HVR1 observados reflejan distintos grados de interacción virus-hospedador durante la infección crónica en niños. La compartimentación del HCV en CMSP contribuye a la persistencia viral también en la infección pediátrica.