OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN CON DETERGENTE Y PURIFICACIÓN HASTA GRADO ELECTROFORÉTICO DE UNA NITRATO REDUCTASA DE MEMBRANA DERIVADA DE SINORHIZOBIUM MELILOTI 2011.

MARIANO ERNESTO PASQUETTO; CARLOS D BRONDINO; FELIX M FERRONI

Santa Fe

Encuentro; XVI Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad nacional del Litoral/ VII Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe; 2012

UNL, UCSF, UTN Santa Fe y FUL

INTRODUCCION   El excesivo uso actual de fertilizantes en tierras de cultivo produce la filtración y acumulación de nitratos en las napas subterráneas. Se ha demostrado que el consumo de aguas conteniendo altas cantidades de estas sales se asocia con metahemoglobulinemia y desarrollo de cáncer gástrico (Van Mannen y col., 1996), por tanto el estudio de los procesos involucrados en el ciclo del nitrógeno resulta de gran interés ecológico. En el ciclo pueden distinguirse varios procesos metabólicos entre los cuales se pueden citar la amonificación y la desnitrificación (Richardson y Watmough, 2005). Estas dos vías metabólicas si bien no conducen al mismo tipo de producto, se inician con la reducción del nitrato por acción de las denominadas nitrato reductasas (NRs) (González y col., 2006). Se han descripto tres tipos de NRs bacterianas responsables de la reacción de la reducción del nitrato a nitrito: una NR asimilatoria citoplasmática (Nas), NR respiratoria unida a membrana (Nar) y una NR periplasmática desasmilatoria (Nap) (Zumft, 1997; González y col., 2006). Siendo las dos últimas las que se encuentran asociadas a procesos de desnitrificación y respiración de nitratos (Zumft, 1996). Las rizobacterias y particularmente Sinorhizobium meliloti cumplen un rol activo dentro de estas vías (Young, 1996). En nuestro laboratorio se han llevado a cabo investigaciones del proceso de desnitrificación en S. meliloti 2011. Recientemente hemos publicado la caracterización de una NR de membrana (NRm) derivada de este microorganismo (Ferroni y col., 2011). Si bien en este trabajo se reporta un protocolo de purificación, el mismo utiliza un proceso de electroelución como paso final, lo cual limita la cantidad de muestra pura a obtener. Como es sabido, en la extracción de proteínas de membranas mediante el uso de detergentes, tanto la concentración del mismo como el tiempo de extracción son fundamentales para reducir el número de pasos de purificación posteriores. Con el fin de obtener muestras de NRm de S. meliloti 2011 de manera más sencilla se decidió optimizar las condiciones de extracción con Triton X-100 y optimizar el proceso de purificación posterior. OBJETIVOS   Optimizar la extracción y la purificación hasta grado electroforético de la NRm de S. meliloti 2011 crecido en condiciones microaeróbicas mediante la solubilización con detergente y protocolos cromatográficos.   METODOLOGIA   Crecimiento de S. meliloti 2011 y producción de la NR de membrana. Las células fueron crecidas en condiciones microaeróbicas a 30 °C mediante cultivos batch en Erlen-Meyers de 1 L de capacidad, en presencia de nitrato 10 mM, por un período de 7 días. Se realizó la disrupción celular mediante el uso de un sonicador y se recuperó la fracción de membranas por centrifugación a 4 ºC y 15000 rpm durante 90 min. El pellet de membranas se resuspendió hasta una concentración proteica máxima de 10mg/ml en buffer 20mM Tris-HCl pH 7,6. Solubilización de proteínas de membrana por medio de detergente. Se trataron las muestras de membranas con una concentración final de detergente en un rango de 0,1-0,5% v/v Triton X-100 y se incubaron las mismas durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente se trataron las muestras de proteína con una concentración final de detergente igual a 0,1 % v/v y se incubaron las mismas durante 15, 30 y 45 min. Se centrifugó cada muestra a 4 ºC y 15000 rpm durante 90 min para separar las membranas de las proteínas obtenidas y así recuperar el extracto de proteínas de membrana. Purificación de la fracción extraída con detergente. Las muestras extraídas con detergente se dializaron a 4 ºC contra un buffer 20mM Tris-HCl pH 7,6 conteniendo 0,05% v/v Triton X-100. La muestra así tratada se sometió a diversos pasos cromatográficos. Se evaluaron distintos tipos de columnas: DEAE-Sepharose (GE Healthcare), Source15Q (GE Healthcare) (S15Q) y Hydroxyapatite Bio-Gel HTP (Biorad) (HTP). Como primer paso se utilizó la columna DEAE con el fin de recuperar la mayor cantidad de actividad posible. Como segundo paso se analizaron los perfiles de elución de la actividad tanto en la columna S15Q como en HTP. Para la columna que proporcionó una mayor recuperación de la actividad, se ensayaron las condiciones de elución en presencia y ausencia de detergente. El seguimiento de la presencia de la proteína se realizó por ensayos de actividad (Ferroni y col., 2011), espectroscopía UV-Vis y determinación del contenido proteico (Bradford, 1976).   RESULTADOS   Se llevaron a cabo dos experiencias con el fin de obtener las condiciones óptimas de extracción de la NRm mediante el uso de detergente: (i) variando la concentración de detergente y utilizando un tiempo de extracción de 30 min, y (ii) variando el tiempo de extracción y utilizando una concentración de detergente de 0,1% v/v. Los resultados se muestran en la figura 1 y figura 2 respectivamente. De las dos figuras se obtuvieron las condiciones óptimas para la extracción de la NRm: 0,1% v/v Triton X-100 y 30 min. La muestra extraída se dializó a 4 ºC contra un buffer 20mM Tris-HCl pH 7,6 conteniendo 0,05% v/v Triton X-100 y 200 µM NaMO4 para disminuir el contenido de detergente al nivel usado durante el proceso cromatográfico, a la vez que restaurar la actividad que pudiera haberse perdido durante el proceso de extracción por eliminación del molibdeno del sitio activo.  Figura 1: Comparación de las extracciones realizadas utilizando diferentes concentraciones de detergente. Cada barra corresponde a la media de 3 determinaciones con su respectivo error. Figura 2: Comparación de las extracciones realizadas durante diferente tiempo. Cada barra corresponde a la media de 3 determinaciones con su respectivo error.   La figura 3 muestra un resumen del protocolo de purificación ensayado. La muestra extraída y dializada se sembró en una columna DEAE-Sepharose y se eluyó mediante la aplicación de un gradiente iónico de 0-600 mM NaCl en buffer 20mM Tris-HCl pH 7,6 conteniendo 0,05% v/v Triton X-100. El pico de elución de la proteína se detectó entre 200 y 350 mM. Se recolectó dicha fracción y se sembró en las columnas S15Q y HTP. Se aplicó un gradiente iónico a cada columna, 0-600 mM NaCl en el caso de la columna S15Q y 0-600 mM PO42- en el caso de la columna HTP. El pico de elución de la proteína para la columna S15Q fue de entre 250 y 400 mM NaCl, y de entre 50 y 150 mM PO42- para la columna HTP. Se analizó la recuperación y el factor de purificación de cada columna y se determinó en base a ello que la columna S15Q resulta más conveniente como segundo paso de purificación (6% contra 0,3% de recuperación). Se analizaron luego las condiciones de elución en la columna S15Q aplicando un gradiente iónico idéntico al anterior pero en presencia y ausencia del detergente. Se analizó nuevamente el porcentaje de recuperación y el factor de purificación de cada condición, y mediante electroforesis en geles de poliacrilamida la calidad de la muestra. En el proceso de purificación sin el uso de detergente se logró obtener una muestra con actividad NRm libre de impurezas. En la  Tabla 1se recopilan los resultados de la purificación. Esta muestra resulta similar a la obtenida en trabajos que utilizaron un proceso de electroelución como paso final de la purificación.     Tabla 1: Rendimiento del protocolo de purificación escogido. Muestra Volumen AEa CPb AE total AEEc Rendimiento FPd (mL) (mUe/mL) (mg/mL) (mU) (mU/mg)  %   Ingreso DEAE 12 39,9 0,35 479,0 114,0 100 Ingreso S15Q 17 13,0 0,10 221,0 130,2 46 1,1 Egreso S15Q sin Triton 0,5 279,0 0,15 139,5 1860,0 29 16,3 Egreso S15Q con Triton 0,5 54,7 0,16 27,4 341,9 6 3,0 a: Actividad enzimática; b: Contenido proteico; c: Actividad enzimática especifica; d: Factor de purificación o enriquecimiento; e: Se define como una unidad de actividad enzimática (U) al consumo/generación de un µmol de sustrato/producto por minuto de reacción.   CONCLUSIONES   Se logró extraer NRm de S. meliloti 2011 de manera eficiente incubando las membranas resuspendidas en un buffer con una concentración de 0,1 % v/v Triton X-100 por espacio de 30 min a temperatura ambiente. Del extracto obtenido se logró purificar la enzima mediante un proceso cromatográfico que involucró un primer paso en una columna de intercambio aniónico DEAE-Sepharose en presencia de detergente, y un segundo paso mediante una columna de S15Q en ausencia de detergente. La muestra de enzima purificada mostró niveles de pureza similares a los obtenidos en otros protocolos que utilizan procesos de electroelución.   BIBLIOGRAFIA BASICA             Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of micrograms cuantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254 Ferroni, F.M, Rivas, M.G., Rizzi, A.C., Lucca, M.E., Perotti, N.I., Brondino, C.D., 2011. Nitrate reduction associated with respiration in Sinorhizobium meliloti 2011 is performed by a membrane-bound molybdoenzyme. Biometals, 24, 891-902. González, P. J., C. Correia, Isabel Moura, C. D. Brondino, and J. J. G Moura., 2006. Bacterial nitrate reductases: Molecular and biological aspects of nitrate reduction. Journal of Inorganic Biochemistry, 100:1015-1023 Richardson, D.J., Watmough, N.J., 1999. Inorganic nitrogen metabolism in bacteria. Curr. Opin. Chem. Biol., 3, 207-219. Van Mannen, J.M.S.; Welle, I.J.; Hageman, G.; Dallinga, J.W.; Martens, P.L.; y Kleinjans, J.C., 1996. Nitrate contamination of drinking water: relationships with HPTR variant frequency in lymphocyte DNA and urinary excretion of N-nitrosamines. Environ. Health Perspect. 104:522-528 Young, J.P.W., 1996 Phylogeny and taxonomy of rhizobia. Plant Soil, 186: 45-52. Zumft, W.G.,1997. Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 533-616.