Factores limitantes en la inducción de muerte celular por Terapia fotodinámica con ALA en cultivos bi y tridimensionales de células de adenocarcinoma de pulmón

TEIJO MJ.; DIEZ B,; MEISS R.; BATLLE A,; FUKUDA H

Buenos Aires

Jornada; XXVII JORNADAS MULTIDISCIPLINARIAS DE ONCOLOGIA DEL INSTITUTO ?ÁNGEL H. ROFFO; 2011

Instituto Roffo

Factores limitantes en la inducción de muerte celular por Terapia fotodinámica con ALA en cultivos bi y tridimensionales de células de adenocarcinoma de pulmón. Teijo MJ1,2, Diez  B1,2, Meiss RP3, Batlle AM1, Fukuda H1,2. 1.- Centro de Investigación sobre Porfirias y Porfirinas (CIPYP) CONICET-UBA 2.- Dto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA 3.- Instituto de Estudios Oncológicos Academia Nacional de Medicina, Buenos Aires, Argentina   Introducción. Las propiedades fotoactivas de las porfirinas al ser irradiadas con luz de longitud de onda adecuada, y la alta selectividad de las células tumorales en el metabolismo de las mismas a partir del precursor ácido 5-aminolevúlico (ALA), conforman la base de la terapia fotodinámica (TFD) mediante la cual se generan especies reactivas de oxígeno (ROS) que inducen la muerte celular. El cultivo de células tumorales en esferoides multicelulares (EMCs) representa un modelo in vitro útil para el estudio de muerte celular post-TFD dado que simula las condiciones de microtumores independientemente de la vasculatura, cuyo rol  en la erradicación de tumores por TFD es controversial. Objetivos. El objetivo del presente trabajo fue establecer los factores condicionantes de la efectividad de la TFD  involucrados en la mayor resistencia a la muerte celular en los esferoides de la línea A549 de adenocarcinoma de pulmón humano respecto de las mismas dosis sobre el cultivo en monocapa : la síntesis de porfirinas, la llegada de la luz o la generación de ROS. Materiales y Métodos. Previamente se reportó la puesta a punto de las condiciones para el cultivo de esferoides, la síntesis de porfirinas y viabilidad post-TFD en ambas conformaciones del cultivo (monocapa: DL50 7 min y EMCs: DL50 10min). Las células se sembraron a una densidad de 5x104 cél/ml de MEM+5% SFB, sobre agar 3%-RPMI (1:1) reemplazando cada 48 hs dos tercios del medio de cultivo, obteniéndose esferoides compactos de 100 - 700 mm de diámetro al cabo de 7 días. Para aplicar la TFD, las células se incubaron con ALA durante 3 h y luego fueron irradiadas durante distintos tiempos en un banco de 2 tubos fluorescentes. Los estudios de muerte celular se realizaron 1 h luego de la TFD. Resultados La síntesis de porfirinas no varió significativamente entre la monocapa (0,109±0,1 pg/cel) y los EMCs (0,09±0,1 pg/cel). La distribución de porfirinas en los distintos planos del esferoide es uniforme, según se observó por microscopía confocal, lo que nos permite inferir que la capacidad de síntesis de porfirinas de las células en EMCs no es el factor limitante en este modelo. Por otro lado, se analizó mediante cortes histológicos la penetración de la luz a través de los EMCs y su efecto en el interior de los mismos. Se evidenció que la luz penetra hasta las capas de células profundas, ya que se observaron células apoptóticas y necróticas en las zonas internas del esferoide de manera dosis lumínica dependiente, confirmado con marcación con Annexina V-FITC/ioduro de propidio, En la histología se observó además una diferenciación con vacuolas de secreción, coincidente con la naturaleza de tumor maligno epitelial secretor de la línea, el cual se desorganiza en los tiempos de irradiación de 10 y 20 min. El estudio de la generación de ROS, en particular oxígeno singulete, el agente fundamental para el inicio del daño fotoquímico, reveló que la producción de esta especie es mucho menor en los EMCs (5,5±2,7%) que en la monocapa (83,5±1,9%) inmediatamente después de la TFD, indicando que la disponibilidad de oxígeno en el esferoide sería el factor que limita la efectividad de la TFD en una configuración tridimensional.