La inhibición específica de deltaNp63 produce alteraciones en el desarrollo de la epidermis de Xenopus laevis

M. GUADALUPE BARRIONUEVO; GABRIELA MARRANZINO; MANUEL J. AYBAR; CELESTE TRÍBULO

Tafí del Valle, Tucumán

Congreso; XXVIII Jornadas de la Asociación de Biología de Tucumán; 2011

Asociación de Biología de Tucumán

El gen p63 cumple una importante función durante el desarrollo de la epidermis en diferentes modelos animales. En mamíferos, este factor de transcripción presenta dos promotores alternativos que generan dos tipos de isoformas (TA y DN). La isoforma transactivadora (TA) contiene un dominio transactivador amino-terminal mientras que la isoforma DNp63 pierde este dominio pero conserva el dominio de unión al ADN (DBD) y el dominio de oligomerización (OD). En Xenopus sólo se clonó la isoforma DNp63 de este gen. Previamente, nuestros estudios determinaron que DNp63 se expresa en la epidermis y es regulado por la señal BMP4. La sobreexpresión de DNp63 promueve la diferenciación epidérmica e inhibe el desarrollo neural mientras que la inhibición del gen mediante el uso de un oligonucleótido tipo morfolino (DNp63MO) produce el efecto opuesto. Con el objetivo de desarrollar una herramienta que permitiera comprobar la eficiencia y especificidad de DNp63MO se construyó una proteína quimérica truncada en el extremo carboxilo-terminal y fusionada a GFP (DNp63(Ct)-GFP). Esta construcción no posee el dominio de oligomerización (OD) de DNp63 y podría actuar como una forma dominante negativa. Mediante “western blotting” se demostró que DNp63MO fue capaz de inhibir la traducción de DNp63(Ct)-GFP en una forma dosis dependiente. Luego se procedió a analizar el rol de DNp63(Ct)-GFP como dominante negativo. Al microinyectar embriones con diferentes concentraciones del mARN de DNp63(Ct)-GFP se observó una disminución en la expresión del marcador epidérmico XK81a y un incremento de los genes marcadores neurales (FoxD3 y Sox2) dependiente de la concentración. Estos fenotipos fueron similares a los observados cuando se inhibe DNp63 mediante el uso de su morfolino. Se observaron resultados similares al realizar experimentos in vitro y analizar los genes marcadores epidérmicos y neurales mediante RT-PCR. Finalmente, se realizaron experimentos de rescate para demostrar que DNp63(Ct)-GFP inhibe específicamente a DNp63. Nuestros resultados indican que la pérdida del dominio OD genera una forma dominante negativa de DNp63 que inhibe específicamente su función modulando a sus genes blanco.