INVESTIGADORES
CASABONA Juan Cruz
congresos y reuniones científicas
Título:
Producción de partículas de tipo viral de arenavirus mediante un sistema de genética reversa
Autor/es:
CASABONA J.C; MARIA T. FRANZE-FERNANDEZ; NORA LOPEZ
Reunión:
Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología 2005; 2005
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Virologia
Resumen:
El virus Tacaribe (VT) es el prototipo de los arenavirus
del "Nuevo Mundo", grupo que incluye los 4 patógenos productores de
fiebres hemorrágicas conocidos en Sudamérica: los virus Junín, Machupo,
Guanarito y Sabia. El genoma de VT consiste en dos segmentos de ARN de simple cadena,
denominados S y L. El segmento S codifica para la nucleoproteína (N) y para el
precursor (GPC) de las glicoproteínas de envoltura G1 y G2. La nucleoproteína
se asocia con ambos segmentos de ARN viral formando las nucleocápsides. En el
segmento L, se encuentran codificadas las proteínas L (polimerasa viral) y una
pequeña proteína llamada Z. Nuestro grupo desarrolló un sistema (de genética
reversa) que reconstituye la transcripción y la replicación de los ARNs virales
a partir de plásmidos que expresan, bajo el control del promotor de la ARN
polimerasa del fago T7 (T7Pol), las proteínas virales y un ARN minigenoma (MG)
que contiene el gen reportero CAT (cloranfenicol acetiltransferasa). Utilizando
este sistema se demostró que N y L son las únicas proteínas virales necesarias
para la transcripción y la replicación del MG, analizadas, respectivamente, por
el dosaje de la actividad de CAT y por la formación de nucleocápsides. Además,
demostramos que las regiones no codificantes 3 y 5 del ARN S del VT contienen
todas las señales promotoras para ambos procesos. En ese sistema, la proteína Z
resultó ser un potente inhibidor de la síntesis de los ARNs de tipo viral.
El objetivo del presente trabajo es estudiar la
posibilidad de producir partículas de tipo viral (PTVs) infectivas utilizando
un sistema de genética reversa. En el sistema desarrollado previamente, la
T7Pol que dirige la síntesis de las proteínas virales y el MG, es producida
durante la infección con un virus vaccinia recombinante. Resultados preliminares
de nuestro grupo indican que la infección con el virus vaccinia inhibe la
síntesis y procesado de las glicoproteínas del VT, imprescindibles para la
formación de partículas infectivas. Por este motivo, para evitar la utilización
de virus vaccinia, desarrollamos un nuevo sistema en el que la T7Pol fue
aportada por co-transfección con un plásmido que la expresa o mediante la
utilización de una línea celular en la que esta enzima es expresada en forma
constitutiva. Para lograr una eficiente traducción de los transcriptos de la
T7Pol, se insertó un sitio de entrada interno de ribosomas (IRES) contiguo al
codón de iniciación de las proteínas virales. Por último, el MG se clonó bajo
el promotor de la ARN Polimerasa I celular (Pol I). Resultados obtenidos por
otros investigadores apoyan la idea de que la proteína Z cumple, además de la
función inhibitoria de la síntesis de ARN viral, una función promotora en la
morfogénesis viral. Por esa razón, para obtener PTVs, los plásmidos que
expresan las proteínas N, L, GPC y T7Pol y el plásmido que expresa el MG se
co-transfectaron en diferentes líneas celulares junto con distintas
proporciones del plásmido que expresa la proteína Z. Se midió la actividad CAT
en las células transfectadas y se determinaron las condiciones óptimas para la
expresión del gen reportero. Luego, se investigó la formación de las PTVs. Para
esto, los sobrenadantes de las células transfectadas en las condiciones óptimas
de expresión de CAT, fueron clarificados y utilizados para infectar células frescas
que fueron posteriormente transfectadas con los plásmidos que expresan las
proteínas N, L y T7Pol. Posteriormente, se ensayó la actividad de CAT en los
extractos citoplasmáticos de estas últimas células. Se presentará la puesta a
punto del sistema y se discutirá la implicancia de la obtención de PTVs para el
estudio de las bases moleculares de la morfogénesis viral.