“Producción de partículas de tipo viral de arenavirus mediante un sistema de genética reversa”

CASABONA J.C; MARIA T. FRANZE-FERNANDEZ; NORA LOPEZ

Congreso; Reunión Anual SAV. Presentación Oral; 2005

Sociedad Argentina de Virologia

El virus Tacaribe (VT) es el prototipo de los arenavirus del "Nuevo Mundo", grupo que incluye los 4 patógenos productores de fiebres hemorrágicas conocidos en Sudamérica: los virus Junín, Machupo, Guanarito y Sabia. El genoma de VT consiste en dos segmentos de ARN de simple cadena, denominados S y L. El segmento S codifica para la nucleoproteína (N) y para el precursor (GPC) de las glicoproteínas de envoltura G1 y G2. La nucleoproteína se asocia con ambos segmentos de ARN viral formando las nucleocápsides. En el segmento L, se encuentran codificadas las proteínas L (polimerasa viral) y una pequeña proteína llamada Z. Nuestro grupo desarrolló un sistema (de genética reversa) que reconstituye la transcripción y la replicación de los ARNs virales a partir de plásmidos que expresan, bajo el control del promotor de la ARN polimerasa del fago T7 (T7Pol), las proteínas virales y un ARN minigenoma (MG) que contiene el gen reportero CAT (cloranfenicol acetiltransferasa). Utilizando este sistema se demostró que N y L son las únicas proteínas virales necesarias para la transcripción y la replicación del MG, analizadas, respectivamente, por el dosaje de la actividad de CAT y por la formación de nucleocápsides. Además, demostramos que las regiones no codificantes 3’ y 5’ del ARN S del VT contienen todas las señales promotoras para ambos procesos. En ese sistema, la proteína Z resultó ser un potente inhibidor de la síntesis de los ARNs de tipo viral. El objetivo del presente trabajo es estudiar la posibilidad de producir partículas de tipo viral (PTVs) infectivas utilizando un sistema de genética reversa. En el sistema desarrollado previamente, la T7Pol que dirige la síntesis de las proteínas virales y el MG, es producida durante la infección con un virus vaccinia recombinante. Resultados preliminares de nuestro grupo indican que la infección con el virus vaccinia inhibe la síntesis y procesado de las glicoproteínas del VT, imprescindibles para la formación de partículas infectivas. Por este motivo, para evitar la utilización de virus vaccinia, desarrollamos un nuevo sistema en el que la T7Pol fue aportada por co-transfección con un plásmido que la expresa o mediante la utilización de una línea celular en la que esta enzima es expresada en forma constitutiva. Para lograr una eficiente traducción de los transcriptos de la T7Pol, se insertó un sitio de entrada interno de ribosomas (IRES) contiguo al codón de iniciación de las proteínas virales. Por último, el MG se clonó bajo el promotor de la ARN Polimerasa I celular (Pol I). Resultados obtenidos por otros investigadores apoyan la idea de que la proteína Z cumple, además de la función inhibitoria de la síntesis de ARN viral, una función promotora en la morfogénesis viral. Por esa razón, para obtener PTVs, los plásmidos que expresan las proteínas N, L, GPC y T7Pol y el plásmido que expresa el MG se co-transfectaron en diferentes líneas celulares junto con distintas proporciones del plásmido que expresa la proteína Z. Se midió la actividad CAT en las células transfectadas y se determinaron las condiciones óptimas para la expresión del gen reportero. Luego, se investigó la formación de las PTVs. Para esto, los sobrenadantes de las células transfectadas en las condiciones óptimas de expresión de CAT, fueron clarificados y utilizados para infectar células frescas que fueron posteriormente transfectadas con los plásmidos que expresan las proteínas N, L y T7Pol. Posteriormente, se ensayó la actividad de CAT en los extractos citoplasmáticos de estas últimas células. Se presentará la puesta a punto del sistema y se discutirá la implicancia de la obtención de PTVs para el estudio de las bases moleculares de la morfogénesis viral.