Interacción de diferentes cepas de Bacillus cereus con macrófagos peritoneales

RACEDO, S.; ROLNY, I.; PÉREZ, P.

Córdoba

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología; 2007

La virulencia de Bacillus cereus es multifactorial y se han demostrado diversos efectos biológicos en enterocitos humanos en cultivo (Caco-2) que varían según la cepa. La interacción de estos microorganismos (Mo) con células fagocíticas profesionales, tales como los macrófagos peritoneales (MQ), es poco conocida. El objetivo de este trabajo fue evaluar la interacción de las cepas M2, T1, B10502 y 2 de B. cereus con MQ de ratones BalbC. Los MQ fueron extraídos de la cavidad peritoneal de ratones de 6 semanas de edad con buffer fosfato (PBS)-albúmina(0,1%)-heparina(0,3%), la suspensión celular fue centrifugada 2500rpm/10min y el pellet fue resuspendido en RPMI con suero bovino fetal (SBF-10%). Se emplearon 200 ul de una suspensión de 10exp6 MQ/ml los cuales fueron infectados con las cepas de B. cereus opsonizadas con SBF (MOI=1:20) y marcadas con 5(6) carboxifluoresceina diacetato succinimidil éster (CFSE;25µM). Se estudió: a) Cinética de muerte celular: se determinaron las UFC a diferentes tiempos post-infección, para ello los MQ fueron lavados 2 veces con PBS y lisados con agua destilada estéril, diluciones apropiadas fueron plaqueadas en agar nutritivo e incubadas 16hs/37ºC. b) Tinción con naranja de acridina (NA): los MQ infectados fueron centrifugados, fijados con etanol absoluto 5min/0ºC, lavados con PBS y coloreados con NA (0,5µg/ml), las preparaciones citológicas fueron evaluadas por microscopía de fluorescencia. c) Ensayo de fagocitosis por citometría de flujo (CF): se evaluó el porcentaje de Mo internalizados a diferentes tiempos post-infección. La fluorescencia de los Mo extracelulares fue apantallada con azul tripán.d) Colocalización de B. cereus marcado con CFSE en lisosomas tardíos, para ello los MQ infectados fueron lavados y resuspendidos en un buffer de homogeinización con inhibidores de proteasas, las células fueron lisadas y el homogenato fue centrifugado para obtener la fracción post-nuclear (FPN). La FPN fue marcada con anti-LAMP-1 marcado con ficoeritrina. Las cepas B10502 y M2 fueron rápidamente depuradas por los MQ comparado con las otras cepas. Los Mo sobrevivientes fueron: B10502:2,5±3,5; M2:27,5±2,1; T1:109,5±19,1; 2:97±2,8 UFC/lisado. Estos resultados estuvieron relacionados con el mayor % de bacterias fagocitadas y asociadas observado para B. cereus B10502 y M2 determinados por CF (B10502:39% y M2:17%) y por tinción con NA (B10502:51,4% y M2:30%), respectivamente. Estas cepas mostraron un mayor % de Mo en lisosomas tardíos (B10502:40,30% y M2:39,47%). Estos resultados agregan una nueva dimensión al estudio de los factores de virulencia de Bacillus cereus y muestran que la variabilidad de los efectos biológicos asociados a este microorganismo podrían estar relacionadas con diferentes patrones de interacción con las células fagocíticas profesionales.