Clonado, expresión y purificación de una proteína de Leptospira interrogans para su evaluación como antígeno de diagnóstico

VIARENGO, GASTÓN; VANASCO, NORMA BIBIANA; LOTTERSBERGER, JAVIER; GUERRERO, SERGIO ADRIÁN

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Santa Fe, Argentina

Jornada; 11º Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral y 2º Encuentro de Jóvenes Investigadores de las universidades de Santa Fe; 2007

Universidad Nacional del Litoral

Introducción: La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial que acarrea serios perjuicios no sólo para la salud pública sino también a la economía regional debido a las pérdidas de días de trabajo de los enfermos (Babudieri 1958; Levett 2001). Es una de las enfermedades infecciosas más importantes, emergente de situaciones de crisis hídricas como las que afectan a Santa Fe (Argentina). En el diagnóstico, los resultados positivos obtenidos por cualquier método serológico deben ser confirmados por la técnica de referencia internacional para la detección de anticuerpos específicos anti-leptospiras: la aglutinación microscópica con antígenos vivos, o por sus siglas MAT (Microscopic Aglutination Test) (Faine 1982). Esta técnica tiene como principales desventajas la menor sensibilidad respecto de las técnicas de tamiz y que requiere la utilización de varios serovares en fase exponencial de crecimiento (Faine 1982). LipL32 es una de las lipoproteínas más antigénicas de la membrana externa de especies patógenas de leptospira. Ha sido reportada su utilidad en el serodiagnóstico de leptospirosis. La secuencia aminoacídica está altamente conservada a lo largo de las especies patógenas de leptospira. La detección temprana y certera de la aparición de brotes de esta infección es relevante para el manejo sanitario en tales situaciones. En Argentina no se cuenta con reactivos que permitan un diagnóstico adecuado de la enfermedad en situaciones de emergencia y esto constituye una limitación sanitaria importante. El presente trabajo pretende desarrollar pruebas de laboratorio con alta especificidad y sensibilidad que permitan contribuir a la solución de este problema. Objetivos: - Clonar el gen que en L. interrogans codifica para LipL32, expresar la proteína recombinante en Escherichia coli y purificarla convenientemente. - Evaluar la utilidad de este antígeno, sólo o en combinación a otros, para el desarrollo de un reactivo de tipo ELISA y determinar la utilidad de éste para el diagnóstico serológico en las diferentes fases de la enfermedad. - Validar este ELISA usando MAT como prueba patrón. Evaluar la eficiencia del reactivo ELISA desarrollado, su reproducibilidad, estabilidad y variabilidad. Consideraciones finales: Los resultados muestran que el antígeno recombinante rLipL32 muestra reactividad altamente específica frente a sueros reactivos de humanos e hiperinmunes de conejo, confirmando su utilidad como candidato para el diagnóstico serológico de leptospirosis. Los resultados del mapeo de epitopes sugieren la existencia de dos regiones antigénicas hacia el extremo carboxilo terminal de la proteina. Éstas regiones reactivas están altamente conservadas entre las especies antigénicas de Leptospira spp. y no muestran homología con secuencias de otros microorganismos. Este descubrimiento tiene relevancia potencial no sólo para el serodiagnóstico sino también como punto de partida en la caracterización de blancos para el diseño de vacunas. Por otra parte, se está trabajando en la obtención de una nueva proteína recombinante, His6-LipL32D133N, que consiste en la fracción antigénica predominante determinada por mapeo de epitopes. Está planificado continuar con la purificación de la misma y la evaluación inmunológica a los efectos de determinar su utilidad como antígeno para serología. Por último, se espera desarrollar un ELISA que permita la detección de anticuerpos antileptospiras en muestras de suero sanguíneo humano, y validar este ELISA usando MAT como prueba patrón.