Motivos estructurales de unión a flavina adenina dinucleótido (FAD) como determinantes de la diferente eficiencia catalítica de ferredoxina/flavodoxina-NADP+ reductasas vegetales y bacterianas

BOTTI, H.; MUSUMECI, M. A.; BUSCHIAZZO, A.; CECCARELLI, E. A.

Piriapolis

Congreso; XIII Jornadas de la Sociedad Uruguaya de Biociencias; 2010

Sociedad Uruguaya de Biociencias

Las oxidorreductasas que unen flavinas son una familia de proteínas esenciales para el metabolismo vegetal plastídico, que se distinguen por su capacidad de catalizar transferencias electrónicas entre dadores y aceptores uni y dielectrónicos. La alta eficiencia catalítica de las ferredoxina-NADP+ reductasas es de capital importancia para permitir el crecimiento y la multiplicación plastídica, por lo que son de gran interés como blancos de transgénesis vegetal. Las flavoenzimas poseen una amplia distribución en los tres reinos, cumpliendo muy diversos roles biológicos. Las flavodoxina-NADP+ reductasas bacterianas se caracterizan por eficiencias catalíticas bajas, además de expresar una especificidad de sustrato característica. Las razones de las diferencias catalíticas de estos dos tipos de flavoenzimas son solo parcialmente comprendidas y son objeto de estudio actual de la División de Biología Molecular del Instituto Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), Argentina. La colaboración de nuestra unidad con dicho centro ha permitido el estudio funcional y estructural de quimeras de flavoenzimas vegetales y bacterianas prototípicas en las que se han intercambiado motivos estructurales de unión al cofactor FAD. Dado que las proteínas salvajes tienen una estructura global muy parecida con excepción de los sitios de union a FAD y de la confroamción del propio cofactor (extendida vs. plegada), se hipotetiza que diferencias estructurales localizadas en dicho sitio son determinantes de dichas diferencias funcionales y que el intercambio de estos motivos estructurales diferenciales podría ser suficiente para “transformar” una isoforma funcional en la otra. Se diseñaron 6 mutantes quiméricos, de los cuales 5 se pudieron obtener como proteínas solubles y bien plegadas de acuerdo con estudios de dicroísmo circular. Se estudió la estabilidad térmica, los parámetros cinéticos enzimáticos y la constante de liberación de FAD (kOFF) de estos mutantes mediante estudios de microcalorimetría de barrido diferencial y espectrofotometría de absorción y de fluorescencia. Además se realizaron estudios cristalográficos por difracción de rayos X de los dos mutantes quiméricos de mayor interés. Los resultados indican que el motivo principal de unión a FAD de las flavoenzimas plastídicas contribuye a la estabilidad proteica y a la estabilidad de la unión a FAD tanto en la isoforma vegetal como bacteriana. Las mutaciones realizadas afectan de forma esperada las características espectroscópicas de las flavoenzimas. Inesperadamente, cualquiera de las mutaciones realizadas determinó efectos detrimentales sobre la eficiencia catalítica de las flavoenzimas quiméricas en lo que respecta a la reducción de NADP+ por ferredoxina o flavodoxina. Finalmente describimos los modelos estructurales obtenidos de las dos quimeras estudiadas por difracción de rayos X, que puestos en comparación con estructuras previas permiten entender nuevos aspectos estructurales de la unión a FAD y NADP+ de las flavoenzimas.