Comparación de la eficiencia de detección de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre murina por PCR convencional y PCR en tiempo real

CAROLINA DAVIES; HUGO R. POMA; RUBÉN CARDOZO; VERÓNICA B. RAJAL; MIGUEL A. BASOMBRÍO

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias.; 2011

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) combinada con métodos serológicos es una excelente prueba diagnóstica e indicadora de éxito terapéutico con agentes anti-T. cruzi en pacientes y modelos animales. Ambas técnicas amplifican fragmentos de específicos de ADN, pero sus métodos de detección son diferentes. En la técnica convencional, el ADN se detecta en un gel de agarosa iluminado con luz UV. En la PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR), la detección se realiza a partir de la fluorescencia acumulada de los amplicones, lo cual permite cuantificarlos al extrapolar sus valores a partir de una curva de calibración. Debido a que la qPCR es cada vez más utilizada, en este trabajo se calcularon sensibilidad, especificidad y concordancia entre ambas para detectar ADN de T. cruzi. Las mismas muestras (sangre de ratones infectados con T. cruzi y tratados con las drogas benznidazol, hidoximetilnitrofurazona, nitrofurazona o placebo) se analizaron por ambas técnicas. Se colocaron 700 uL de sangre en 1400 uL de buffer guanidina, y a las 24 hs se hirvieron por 10 min. Para PCR convencional, la extracción de ADN se realizó con fenol:cloroformo:isoamílico (reacción: 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,1 uM primers 121 y 122, 1,65 unidades de GoTaq polimerasa y 10 uL ADN, amplificación hot start). Para qPCR se empleó el kit de Qiagen para muestras de sangre y tejido, agregando cada muestra una alícuota con un segmento de ADN de Arabidopsis thaliana como control interno (reacción: 1X de SybrGreen, 1000 nM de primers Sat y 5 uL ADN). La amplificación se realizó según las recomendaciones de SybrGreen (Invitrogen) seguida de un protocolo de disociación a 60 ºC. La curva de calibración de T. cruzi se realizó con sangre murina infectada artificialmente con una concentración final de 106 parásitos/mL, realizando diluciones seriadas 1/10 de ADN en un rango de 105 a 10-3 parásitos/mL. De las 25 muestras analizadas por ambos métodos, 5 resultaron positivas y 20 negativas por qPCR, mientras que por PCR convencional sólo se detectaron 2 positivas y 23 negativas. El análisis estadístico reveló que la qPCR tuvo 100% de sensibilidad y 87% de especificidad tomando como referencia a la PCR convencional. A la inversa, la sensibilidad de la PCR convencional fue de 40% en este caso, con una especificidad de 100%. El valor de Kappa (0,52) demostró que la concordancia entre ambas técnicas es moderada Las diferencias pueden deberse a que los métodos de extracción de ADN fueron diferentes, y en la extracción fenólica quedan inhibidores de la polimerasa que luego interfieren en la reacción.