SELECCION DE GENES DE REFERENCIA (GR) PARA LA DETERMINACION DE MICROARNS HEPATICOS POR REAL TIME PCR CUANTITATIVA EN MODELOS DE HEPATOTOXICIDAD EXPERIMENTAL EN LA RATA

LARDIZABAL M.; NOCILO A; DANIELE S.; OMELLA L; PALATNIK J; VEGGI L.

Mar del Plata

Congreso; REUNIÓN ANUAL CONJUNTA SAIC-SAFIS-AACYTAL; 2011

Sociedad Argentina de Investigaci6n Clinica-Sociedad Arge-ntina de Fisiologia-Asociacion Argentina de Ciencia y Tecnología de Animales de Laboratorio

  La hepatotoxicidad es una patología que involucra un daño al hígado debido a la exposición a un xenobiótico. La respuesta a este daño se manifiesta en una importante alteración celular del patrón de expresión génica. Los microARNs (miRs) son moléculas de ARN pequeñas (21-23 nt) no codificantes que regulan negativamente la expresión génica a nivel post-transcripcional. La evaluación de la participación de los miRs en los fenómenos de hepatotoxicidad implica contar con una técnica adecuada de medición de la expresión génica. La técnica de referencia para la determinación de miRs es la Stem-Loop Real Time qPCR, la cual requiere normalizar los resultados respecto a un gen endógeno de expresión estable en los grupos en estudio. El objetivo del trabajo fue seleccionar, a partir de un conjunto de potenciales GR (5S, U6, miR-16, miR-Let7a y RNU48), aquellos que se expresan más establemente en modelos de hepatotoxicidad en la rata. Para ello, se estudió la expresión de los genes en  hígados de ratas tratadas con tioacetamida (i.p.; 0, 10, 50, 150 mg/kg; n=8), tetracloruro de carbono (i.p.; 0, 0.1, 0.4, 0.7 ml/kg, n=8), acetaminofeno (i.p.; 0, 0.5, 0.75, 1, 2 g/kg, n=10) y D-galactosamina (i.p.; 0, 0.2, 0.5, 0.9 g/kg, n=8) y sacrificadas a las 24 hs. Se determinaron los niveles de marcadores séricos de daño hepático (ALT y AST) y se realizaron estudios anatomo-patológicos para corroborar los modelos experimentales establecidos. Se extrajo el ARN hepático total, sobre el cual se midieron los niveles de expresión de los GR candidatos mediante Stem Loop RT-qPCR. Se corroboró la no existencia de diferencias de expresión estadísticamente significativas entre grupos controles y tratados con los hepatotóxicos. Posteriormente, se emplearon las aplicaciones GeNorm y NormFinder para identificar los genes de expresión más estable, resultando los genes 5S y miR-16 como los más adecuados para la normalización de la expresión génica de miRs en los modelos de hepatotoxicidad establecidos.