NUEVO MÉTODO AUTOGRÁFICO BASADO EN LA INMOVILIZACIÓN EN GELES PARA LA DETECCIÓN DE INHIBIDORES DE α-GLUCOSIDASA

CAPOZZA, GIULIANA P; SALAZAR, MARIO O; RAMALLO, I AYELEN; FURLAN, RICADO L E

Rosario

Congreso; XXV Congreso y la XLIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2023

Sociedad de Biologia de Rosario

Los métodos autográficos, al combinar cromatografía en capa delgada (CCD) condeterminación de actividad in situ, permiten visualizar sobre la superficie de una placa el o losconstituyente(s) activo(s) de una mezcla facilitando el aislamiento de los mismos. Así, elanálisis dirigido por efecto resulta conveniente para el descubrimiento de inhibidoresenzimáticos a partir de mezclas complejas de composición desconocida. La α-glucosidasa(α-glu) es una enzima implicada en el metabolismo de carbohidratos. Está involucrada en elcontrol de la liberación de glucosa absorbible, y la inhibición de su actividad es uno de losvarios enfoques para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). En los últimos años,muchos programas de investigación se han centrado en buscar inhibidores de α-glu en fuentesnaturales con el fin de identificar alimentos funcionales o compuestos líderes para el tratamientode la DM2. Como resultado, se han aislado muchos inhibidores de α-glu que sonfitoconstituyentes, como flavonoides, alcaloides, terpenoides, antocianinas, glucósidos, compuestos fenólicos, etc. En 2009 se reportó el primer ensayo autográfico para detectarinhibidores de α-glu. Posteriormente, el mismo set de reactivos se utilizó en versionesmodificadas. El objetivo de este trabajo es optimizar un nuevo ensayo autográfico para detectarinhibidores de α-glu. Para tal fin, inicialmente se evaluó la influencia de diferentes variablessobre la intensidad del color obtenido, incluyendo: concentración de α-glu, sustrato (2-naftil-α-D-glucopiranósido, S) y revelador (Fast Blue, R), temperatura y tiempo de incubación, soluciónbuffer (tris, fosfato y acetato) y valor de pH (entre 5 y 8). Posteriormente, se analizó lafactibilidad de inmovilizar a la α-glu por atrapamiento en gel, utilizando dos gelificantes: agar,un polímero hidrofílico; y plurónico, un copolímero anfifílico. Finalmente, se evaluarondistintos protocolos para la incorporación de los reactivos restantes (S y R) sobre placas de CCD(fase normal, FN y fase reversa, FR) sembradas con cantidades decrecientes de acarbosa(inhibidor de referencia) a fin de seleccionar la condición de mayor sensibilidad. Se observó queel ensayo es sensible al tipo de buffer y al valor de pH, al tiempo de incubación, a lasconcentraciones de los reactivos y al orden de incorporación de los mismos. El ensayoautográfico optimizado alcanzó un límite de detección de 0,0625 μg para acarbosa. Lainmovilización de la enzima en geles permitió determinar de manera precisa la cantidad por cm2que se incorpora, dando una visión más cuantitativa respecto a los métodos reportados hasta elmomento. A su vez, y teniendo en cuenta que la incompatibilidad de la FR es una limitacióncomún a los métodos en los que se emplea gel de agar, se adaptó el ensayo para esta faseestacionaria utilizando un gel anfifílico. El ensayo autográfico desarrollado se empleó paraestudiar un extracto metanólico de Ilex paraguariensis A. St.-Hil. Exitosamente, se logróidentificar ácido clorogénico como uno de los principales responsables de la actividadinhibitoria de α-glu de esta mezcla. Considerando que los reactivos empleados pueden sufrirreacciones secundarias que resulten en falsos positivos, se desarrolló además un ensayo controlanálogo al autográfico en el cual se suprime el agregado de α-glu. Estos resultados demuestranque el ensayo desarrollado es capaz de detectar inhibidores de α-glu presentes en matricescomplejas.