CARACTERIZACION DE LA ACTIVIDAD LACASA PRODUCIDA POR TRAMETES VILLOSA LBM 018

EVELIN VALDÉS RÍOS; LAURA ORTELLADO; GUSTAVO KRAMER; MARÍA FONSECA; ALICIA ARES

Posadas

Jornada; X Jornadas Científico-Tecnológicas de la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales (50 Años); 2023

FCEQyN-UNaM

Las Lacasas (E.C 1.10.3.2) son polifenol oxidasas que catalizan la oxidación de compuestos fenólicos y aminas aromáticas utilizando oxígeno molecular como aceptor de electrones. Actualmente, existe un marcado interés en el empleo de esta enzima en varios procesos industriales, tales como biopulpado, eliminación de colorantes textiles, biodetección y eliminación de compuestos fenólicos, entre otros. Uno de los principales productores de estas enzimas son los hongos de pudrición blanca (WRF). Estos hongos Agaricomycetes se caracterizan por degradar eficientemente la madera y son los únicos capaces de degradar la lignina a dióxido de carbono y agua a través de la secreción de enzimas ligninolíticas entre las cuales las Lacasas juegan un rol fundamental. El aislamiento y cultivo de estos hongos de elevada actividad enzimática y procedente de aislamientos realizados en la provincia de Misiones presenta un potencial biotecnológico para la región. Por tanto, el objetivo principal en este trabajo fue caracterizar la actividad lacasa producida por el WRF Trametes Villosa LBM 018 aislado de madera en descomposición en Misiones.Trametes Villosa LBM 018 se cultivó a 29ºC en medio líquido conteniendo extracto de levadura 2,3 g/L, bagazo de mandioca 6,25 g/L y CuSO4 0,88 mM a pH 3,5 durante 14 días. La actividad de la Lacasa se determinó usando 2,6-dimetoxifenol (DMP) 5 mM en buffer acetato de sodio 0,1 M. El cambio de absorbancia se monitoreó a 469 nm (ε469 = 27,5 mM−1 cm−1) en un espectrofotómetro Shimadzu UV-3600. Se evaluaron las condiciones óptimas de actividad por medición a diferentes pH (3,6; 4,0; 4,8; 5; 6) y temperaturas (25°C; 30°C; 40°C; 50°C; 60°C). Luego se determinó la termoestabilidad, previa incubación del extracto por 6 horas a diferentes temperaturas (25°C; 30°C; 40°C; 50°C) y pH (4,0; 4,8; 5,0), realizando mediciones cada hora a 30°C en condiciones óptimas de pH. El peso molecular de la enzima lacasa se evaluó por SDS-PAGE al 12% y se comparó con un marcador de peso molecular (Kaleidoscope, BioRad). El SDS se eliminó mediante incubación durante 30 minutos del gel en acetato de sodio 50 mM con Tritón X-100 al 0,2 % seguido de tinción con DMP 5 mM y ABTS (2,2-azinobis (3-etilbenztiazoline-6-sulfonato) 1,2 mM en solución buffer acetato de sodio pH 3,6 (0,1M) para evidenciar las bandas. Bajo estas condiciones de cultivo se logró obtener una actividad enzimática de 1000 UL-1. La actividad enzimática fue óptima a pH 4 y a 50°C. La actividad lacasa se mantuvo por encima del 80% durante 6 horas en diferentes temperaturas y pH excepto a (pH 4,0) donde descendió al 70 % de la actividad a las 6 horas. En la zimografía se detectó una enzima lacasa de 40kDa aproximadamente. En base a los hallazgos, se puede concluir que la enzima lacasa producida por T. villosa LBM 018 muestra una prometedora estabilidad en diversas condiciones, lo cual la hace adecuada para posibles aplicaciones biotecnológicas.