ENSAYO AUTOGRÁFICO SIMPLE PARA LA DETECCIÓN DE INHIBIDORES DE PEROXIDASA

RAMALLO, I AYELEN; MICHELONI, OSCAR B; FARRONI, ABEL E; FURLAN, RICARDO L E

Rosario

Jornada; II JORNADAS DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA FBIOyF UNR; 2023

Facultad de Ciencias Bioquimicas y Farmaceuticas UNR

La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los alimentos más consumidos en el mundo. Durante su procesamiento sufre pardeamiento superficial, lo cual disminuye su valor comercial. Este proceso se debe, en parte, a la actividad de la enzima peroxidasa (POD), por lo que su inactivación es una estrategia anti-pardeamiento. Debido a la creciente preferencia de los consumidores por aditivos alimentarios no sintéticos, la búsqueda de agentes anti-pardeamiento en extractos vegetales está cobrando especial interés, implicando la necesidad de trabajar con mezclas complejas de compuestos. La cromatografía en capa delgada (CCD) combinada con determinación in situ de una actividad es un formato adecuado para el análisis dirigido por efecto de muestras complejas. La POD cataliza la oxidación de una gran variedad de co-sustratos donantes de electrones como el ABTS (2,2´-azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]-sal de diamonio) en presencia de H2O2. Sin embargo, el uso de la producción de ABTS•+ como reportero puede conducir a una subestimación de la actividad POD, si se produce una reacción entre el radical y compuestos antioxidantes de la muestra estudiada. Este trabajo comprende el desarrollo de un ensayo autográfico con POD de papa inmovilizada en agarosa, una adaptación del ensayo ABTS•+ como control a fin de detectar falsos positivos, y su aplicación para el estudio de dos extractos vegetales. Se ensayaron varios protocolos durante la puesta a punto de las condiciones del ensayo POD. Los mejores resultados se obtuvieron vertiendo sobre la placa de CCD una solución conteniendo agarosa, ABTS, H2O2 y POD en buffer fosfato (0,031 mmol/cm2, 0,239 µmoles/cm2 y 84,04 U/cm2 respectivamente). El cálculo del límite de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) se realizó por triplicado midiendo los halos de inhibición y mediante regresiones no-lineales. La quercetina presentó un LOD de 0,16 µg y un LOQ de 0,54 µg en el ensayo POD, y un LOD de 0,15 µg y un LOQ de 0,49 µg en el ensayo control. La estabilidad del color de la matriz del ensayo POD se realizó mediante análisis de imágenes empleando el sistema CIEL*a*b*, siguiendo la evolución de los valores de la coordenada a* en el tiempo. El aumento de la coloración se vuelve significativo entre los 30-60 minutos. La diferencia total de color se empleó para medir el contraste halo/matriz. El mejor contraste se observó a los 70 minutos. El sistema desarrollado fue capaz de detectar eficientemente quercetina en un extracto de Solidago chilensis Meyen, en cantidades no detectadas bajo luz UV254. Finalmente, un extracto de Cichorium intybus L. se analizó mediante ensayo autográfico POD y ABTS•+ control. Los resultados mostraron una zona más clara en la autografía POD ausente en el control, sugiriendo la presencia de compuestos que inhiben la enzima pero que no tendrían actividad antioxidante. El ensayo desarrollado puede detectar componentes inhibidores de POD de papa en mezclas complejas, y diferenciar entre inhibidores de POD puros y captadores de radicales ABTS•+ antes de que se inicie un fraccionamiento. La información proporcionada sería útil para tomar decisiones operativas que ahorren tiempo y recursos. Este ensayo puede ampliarse para buscar inhibidores para el pardeamiento en otros vegetales y productos alimenticios derivados.