Producción heteróloga de biocatalizadores para la glicosilación de compuestos bioactivos

ROCIO DE LEON; MARIO CAMPO; ALEXANDER FRIES; GRISELDA CORRAL; JAVIER D. BRECCIA; MICAELA BAGLIONI; LUIS LOPEZ; GISELA WEIZ; LAURA S. MAZZAFERRO

Jornada; Jornada CyT UNLPam; 2023

En la naturaleza, existe una diversidad de compuestos bioactivos, muchos de los cuales se encuentran en forma de glicoconjugados. La incorporación de un residuo glicosídico puede realizarse mediante biocatálisis, por medio de una transglicosilación. Lograr enzimas en cantidades adecuadas es el primer paso para la prospección de un proceso de síntesis. En este trabajo se llevó a cabo la producción heteróloga de glicosidasas que serán utilizadas para la transglicosilación de moléculas de interés: la α-L-ramnosil-β-D-glucosidasa (αRβG) I y II de Acremonium sp. DSM 24697, las cuales se expresaron en Pichia pastoris. Se optimizó el proceso, el cual permitió alcanzar una máxima actividad enzimática a las 72 horas de cultivo; obteniéndose 4,7 U/ml para la αRβG I y 2,2 U/ml para αRβG II. Tambien se llevó a cabo la producción del Citocromo P450 de Actinoplanes missouriensis y su partner redox (reductasa) de Pseudomonas putida, previendo la modificaciónn de moléculas no hidroxiladaas. Se utilizó Escherichia coli como organismo host y se optimizaron los tiempos (48-96 h) y temperatura (28-36°C) de cultivos sumergidos utilizando medio de autoinducción. Por último, se desarrolló un método de detección por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-UV) para los compuestos ácido-4-aminobenzoico y ácido 4-hidroxibenzoico, productos de reacción del P450 con los sustratos utilizados. La producción de las enzimas mencionadas y la detección de los productos mediante HPLC-UV permitirá el acoplamiento de reacciones de hidroxilación y transglicosilación para la diversificación de estructuras químicas de interés.