DESARROLLO DE NUEVO MÉTODO AUTOGRÁFICO PARA LA DETECCIÓN DE INHIBIDORES DE LA ENZIMA α-GLUCOSIDASA

CAPOZZA, GIULIANA; SALAZAR, MARIO O; RAMALLO, I AYELEN; FURLAN, RICADO L E

Rosario

Jornada; XVII JORNADAS DE CIENCIA, TECNOLOGÍA e INNOVACIÓN 2023; 2023

Universidad Nacional de Rosario

Los métodos autográficos, al combinar separación cromatográfica con determinación deactividad in situ, permiten la visualización en una placa del o los constituyente(s) activo(s)presentes en mezclas facilitando el aislamiento de los mismos.1 La αglucosidasa (αglu) esun blanco terapéutico importante para la diabetes tipo 2 y las infecciones virales.2 En 2009se reportó el primer ensayo autográfico para la detección de inhibidores de αglu.3Seguidamente, se ha replicado esta metodología con mínimos cambios. El objetivo de estetrabajo es optimizar un nuevo ensayo autográfico para detectar inhibidores de αglu. Para talfin, se consideró la influencia de diferentes variables sobre la intensidad del color obtenido,incluyendo: concentración de sustrato (2-naftil-α-D-glucopiranósido, S) y revelador (fastblue, R), temperatura, tiempo de incubación, solución tampón (tris, fosfato y acetato) y valorde pH (entre 5 y 8). Luego, se adaptó el ensayo a un formato gel (agar o carbopol) evaluandodiferentes protocolos con el objeto de obtener la mayor sensibilidad posible utilizando elinhibidor de referencia acarbosa. Se observó que la prueba es sensible al tipo de buffer y alvalor de pH, al tiempo de incubación, a las concentraciones y orden de incorporación dereactivos. La inmovilización en gel permitió determinar de manera precisa la cantidad deenzima por cm2que se incorpora dando una visión más cuantitativa respecto a los métodosreportados hasta el momento. El protocolo optimizado alcanzó un límite de detección de0,03125 μg de acarbosa. Finalmente, se aplicó el ensayo para revelar la presencia deinhibidores en un extracto metanólico de Ilex paraguariensis A. St.-Hil. Con el mismo, esposible detectar inhibidores de α-glu presentes en matrices complejas, logrando identificaral ácido clorogénico como uno de los principales responsables de la actividad de esta mezcla.Finalmente, y considerando que los reactivos empleados pueden sufrir reaccionessecundarias que resulten en falsos positivos, se desarrolló un ensayo control análogo alautográfico en el cual se suprime el agregado de αglu.