Terapia génica con el factor de crecimiento símil insulina 1 en astrocitos hipocampales de ratas viejas

ANA ABRIL VIDAL ESCOBEDO; FACUNDO PERALTA; JULIA DIAZ BALIERO; JOAQUIN PARDO; PAULA CECILIA REGGIANI

La Plata

Jornada; Jornada de Investigación 2023. FCM. UNLP; 2023

Facultad de Ciencias Médicas. UNLP

Introducción: En humanos y ratas, la edad avanzada está asociada a un progresivo deterioro del aprendizaje y la memoria. Además, el envejecimiento trae aparejado numerosas alteraciones anatómicas, fisiológicas y de expresión génica en el hipocampo, una estructura clave en la formación y consolidación de la memoria. Entra ellas se ha visto en esta región que los astrocitos son menos numerosos, más pequeños y con ramificaciones más cortas y escasas. En este contexto, hipotetizamos que la sobreexpresión de un potente factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico símil insulina tipo 1 (IGF1), en astrocitos hipocampales de ratas viejas modulará sus funciones tróficas lo que tendrá un impacto positivo en el comportamiento de los animales.Objetivos: 1)- Analizar la arborización de astrocitos transducidos con un vector viral adeno-asociado (AAV) bicistrónico que sobreexpresa IGF1, seguido de la proteína fluorescente roja tdTomato (gen marcador que permite observar las células transducidas) bajo un promotor específico de astrocitos. 2)- Evaluar si la sobreexpresión de IGF1 en astrocitos hipocampales induce una mejora en la cognición de ratas viejas.Materiales y métodos: Vectores utilizados: Previamente generamos un AAV bicistrónico, impulsado por el promotor gfaABC1D (específico para células GFAP+), el AAV9-gfaABC1D-IGF1-ires-tdTomato (AAV-IGF1) y, el vector control que expresa la proteína fluorescente verde GFP, el AAV-gfaABC1D-GFP-ires-tdTomato (AAV-GFP). Análisis de Sholl en astrocitos transducidos con los AAV (Obj. 1): Se utilizó el análisis de Sholl para estudiar la complejidad de los astrocitos transducidos con los AAV-IGF1 y el AAV-GFP. Brevemente, el día experimental (DE) 0, ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 2 meses de edad fueron inyectadas en el hipocampo con 2x1013 copias genómicas/2 μl de los vectores correspondientes (IGF1 N=4, GFP N=5). El DE 21 se realizó la eutanasia de las ratas. Los cerebros fueron fijados y cortados para su posterior análisis por inmunofluorescencia para GFAP. Se capturaron imágenes de fluorescencia de astrocitos (GFAP+) con un microscopio confocal, se trazaron las prolongaciones de las células, se cuantificó el número de intersecciones por anillo (distancia entre cada uno de 5 μm) y se estimó la longitud total de cada astrocito. Terapia génica (TG) con IGF1 en astrocitos hipocampales de ratas viejas (Obj. 2): Se utilizaron ratas hembra SD de 20 meses de edad, divididas en 2 grupos: Intactas (n=6) e IGF1(n=8). Test de comportamiento: El test de enterramiento de bolitas (marble burying, MB) evalúa el enterramiento de bolitas y es utilizado para estudiar comportamiento típico de especie. El test de campo abierto (Open Field, OF) que permite evaluar sistemáticamente la exploración vertical (rearing) de un ambiente nuevo. El test de reconocimiento de objeto nuevo (Novel object Recognition, NOR) que evalúa la memoria de reconocimiento de objeto. El test de Barnes (LB) que evalúa el aprendizaje y la memoria espacial. En los días experimentales (DE) -5 a -3, se realizaron los test MB, OF y NOR, a todos los animales. En el DE 0, mediante cirugía estereotáxica, se realizó la inyección bilateral del AAV-IGF1, en el hipocampo de los animales IGF1. Entre los DE 42-51 se realizaron test comportamentales para evaluar el comportamiento típico de especie, la actividad exploratoria, la memoria de reconocimiento de objeto nuevo y la memoria espacial. Luego, en el DE 52 se realizó la eutanasia de los animales. Resultados: El análisis morfométrico de los astrocitos de ratas inyectados con el AAV-IGF1 mostró un significativo aumento de la arborescencia y longitud de las prolongaciones respecto al grupo control. En el estudio de TG, las ratas que recibieron el AAV-IGF1 mostraron una mejora en el comportamiento y en la performance cognitiva, evidenciada por un aumento de la exploración vertical y una mayor memoria de reconocimiento de objeto a largo plazo. Por consiguiente, la sobreexpresión de IGF1 en astrocitos logró una mejora en ciertos comportamientos deteriorados en las ratas viejas.Conclusiones: El factor neurotrófico IGF1 puede actuar sobre la población de astrocitos cerebrales, promoviendo un aumento de su complejidad y pudiendo presentar un potencial efecto positivo para el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Mediante una estrategia terapéutica promisoria, utilizando un vector genético novedoso y efectivo, dirigido con una alta especificidad a astrocitos hipocampales de ratas viejas, pudimos modular la expresión de IGF1 en estas células lo que frenó el declive del comportamiento y mejoró la memoria de las ratas.