Sobreexpresión selectiva de GDNF mediada por virus adeno-asociado astrocito-selectivo como abordaje terapéutico en un modelo de Enfermedad de Alzheimer en rata

FACUNDO PERALTA; ANA ABRIL VIDAL ESCOBEDO; JULIETTE LÓPEZ HANOTTE; JUAN IGNACIO POSADA; PAULA CECILIA REGGIANI; JOAQUIN PARDO

La Plata

Jornada; Jornada de Investigación 2023. FCM. UNLP; 2023

Facultad de Ciencias Médicas. UNLP

La enfermedad de Alzheimer esporádica (EAe) representa la forma más frecuente de demencia, manifestándose a través de la progresiva pérdida de la memoria y el declive cognitivo. Se observa un impacto significativo en el hipocampo (Hc), acompañado por una marcada reactividad de las células astrocíticas. Hemos investigado el modelo de EAe en ratas, inducido mediante la administración intracerebroventricular (icv) de estreptozotocina (STZ), identificando que los animales presentan manifestaciones conductuales e histopatológicas características de la enfermedad y nos hemos propuesto desarrollar terapias orientadas a fortalecer las funciones de protección tanto neuronal como glial, y/o incrementar las capacidades homeostáticas y moduladoras de los astrocitos. el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) ha surgido como un factor promisorio dada su capacidad para fomentar la supervivencia y el funcionamiento neuronal. Se planteó como objetivo construir y caracterizar la expresión génica recombinante de un vector viral adeno-asociado (AAV) bicistrónico astrocito-selectivo que sobreexpresa GDNF, seguido de la proteína reportera fluorescente tdTomato. Evaluar en el tiempo (7, 14 y 21 días post-inyección) la expresión de los vectores construidos. Explorar los efectos de la implementación de un abordaje terapéutico preventivo con GDNF en astrocitos hipocampales en el modelo de EAe. Se utilizó un sistema de tres plásmidos para producir AAVs de serotipo 9 bicistrónicos impulsados por el promotor gfaABC1D (específico para células GFAP+). Los casetes gfaABC1D-GDNF-ires-tdTomato y gfaABC1D-GFP-ires-tdTomato se transfectaron en células HEK293. Después de 4 días, los AAV producidos se purificaron y titularon mediante qPCR dirigida a repeticiones invertidas. Los AAV fueron caracterizados mediante RT-qPCR, inmunohistoquímica (IHQ).Se inyectaron en Hc de rata ambos AAV y tres semanas después, se fijaron algunos cerebros para realizar IHQ, mientras que el resto se disecaron para extraer ARN y analizar la expresión génica mediante RT-qPCR. Se inyectaron animales con el AAV-GFP en Hc y se procesaron los cerebros a los 7, 14 y 21 días post-inyección para evaluar expresión proteica realizando IHQ marcadora de GFP. Para la exploración terapéutica, se utilizaron ratas macho jóvenes que se dividieron en 4 grupos (n=7/8 por grupo): SHAM, STZ, GFP y GDNF. En el Día Experimental (DE) -28, los animales recibieron inyecciones bilaterales de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) (grupos SHAM y STZ) o AAV-GFP/GDNF (grupos GFP y GDNF). En el DE 0, los animales recibieron bilateralmente icv LCRa (grupo SHAM) o STZ (3mg/Kg) (grupos STZ, GFP y GDNF). Entre los DE +17/+26 se realizaron test comportamentales y mnemónicos para evaluar comportamiento típico de especie, memoria de reconocimiento de objeto nuevo y la memoria espacial. Luego, en el DE +27 se realizó el sacrificio de los animales. Se generaron los AAV-GDNF y AAV-GFP, y se confirmó la sobreexpresión de los transgenes mediante RT-qPCR y por IHQ. La expresión proteica de nuestros vectores fue confirmada a los 7 días post-inyección. Respecto a la terapia in vivo, encontramos que los animales pertenecientes a los grupos STZ y GFP mostraron deterioro significativo (P