Producción y Purificación del Factor de Crecimiento Insulínico recombinante, a partir de un sistema procariota.

ANTONELLA VERA; LESLY VELASQUEZ; SILVIA L. SOTO ESPINOZA; GRASSELLI MARIANO

Bernal

Jornada; Jornadas de investigadores e investigadoras en formación en ciencia y tecnología-JIF 2023; 2023

Universidad Nacional de Quilmes

El objetivo de este trabajo es producir y purificar el Factor de Crecimiento recombinante (FCr) análogo del IGF que será a futuro utilizado como suplemento de medios de cultivo definido para el cultivo de células animales. El sistema de expresión empleado fue E. coli. Los resultados obtenidos nos permiten escalar el proceso de producción y continuar con la optimización de la purificación. Escherichia coli (E. coli) es el microorganismo procariota más utilizado en la industria biotecnológica para la producción de proteínas recombinantes con fines diagnósticos o terapéuticos debido a las grandes ventajas que ofrece como hospedador respecto a otros sistemas. El FCr tiene un peso molecular de 9 kDa, un elevado efecto antiapoptótico vía el receptor IGF-1 e impulsa el crecimiento y la productividad celular de diferentes líneas celulares por lo que se lo considera como un potencial suplemento de medios definidos libres de suero. El trabajo inició con la generación del banco celular maestro, el banco celular de trabajo y el estudio de la productividad de los clones recombinantes obtenidos. Posteriormente, se continuó con la producción del FCr en frascos erlenmeyers, recuperación de los Cuerpos de Inclusión (CI) y desarrollo del proceso de purificación. Se estudiaron diferentes condiciones en la purificación, como lavado de los CI a distintos pHs (6.5, 7.5 y 8.5), con presencia/ausencia de tritón 0.1 % y urea; solubilización de los CI a diferentes concentraciones molares de urea (2 y 8 M) y diferentes temperaturas (ambiente y -20 °C). Finalmente, se realizó la puesta a punto de las técnicas cromatográficas: de exclusión molecular (CEM) y de Intercambio Iónico (CII). Todas las muestras se analizaron mediante absorbancia 280 nm en el espectrofotómetro NanoDrop ND 1000, y en geles de SDS-PAGE. Se obtuvo el banco celular maestro y el de trabajo, a partir de las colonias más productivas. Se logró expresar el FCr en escala analítica. Se optimizaron las condiciones de recuperación, lavado y solubilización de los cuerpos de inclusión. El lavado fue mejor a pH 8.5 y la solubilización con urea 8 M. En la purificación por C.I.I la mejor condición de adsorción fue a pH 4. Los resultados obtenidos permiten escalar el proceso de producción del FCr y continuar con la optimización de la purificación. Además, permitirá a futuro su evaluación como suplemento de medios de cultivo definidos en cultivos de células animales.