Desarrollo de microsatélites como marcadores moleculares en Yerba Mate

MONTENEGRO, F; RAÚL ACEVEDO; LUNA C

Corrientes

Congreso; XXVII Comunicaciones Científicas y Tecnológicas; 2023

UNNE

Los marcadores moleculares son herramientas poderosas para analizar la diversidad del genoma dentro de una especie y paraevaluar las relaciones genéticas entre individuos y poblaciones. Los microsatélites, también conocidos como “repeticiones desecuencia simple” (simple sequence repeats, SSR) o “repeticiones cortas en tándem” (short tandem repeats, STR), se definen comosecuencias repetidas de una a seis bases nucleotídicas que se encuentran en los genomas nucleares y plastídicos de eucariotas. Suanálisis y clasificación es una de las técnicas más indicadas para estudiar el polimorfismo entre secuencias de ADN. Estosmarcadores moleculares se basan en una reacción de PCR que detecta variaciones de loci de secuencias repetitivas. Presentanaltos niveles de polimorfismo, herencia codominante, multialelismo, patrón mendeliano y buena cobertura genómica. Losmicrosatélites requieren poca cantidad de ADN, pueden automatizarse fácilmente para un cribado de alto rendimiento, puedenintercambiarse entre laboratorios y son altamente transferibles entre poblaciones. El objetivo general de este trabajo es desarrollarun protocolo de amplificación de microsatélites para utilizarlos como marcadores moleculares en Yerba Mate. Para alcanzar esteobjetivo, se plantearon dos objetivos particulares: identificar y clasificar microsatélites en secuencias genómicas, y optimizarprotocolos de amplificación de microsatélites. En cuanto a la identificación y clasificación de microsatélites, se descargaron lassecuencias del genoma de Ilex paraguariensis del repositorio "Assembly" del NCBI y se utilizó el programa KRAIT v1.3.3 parabuscar, analizar y clasificar las secuencias compatibles con las características de los microsatélites. Los SSRs seleccionados seinvestigaron mediante la herramienta BLASTn en la base de datos de la NCBI y se eliminaron las secuencias con similitud enmicroorganismos que podrían provenir de una contaminación del material vegetal con microorganismos. Para diseñar los primersespecíficos para los microsatélites seleccionados se utilizó la herramienta en línea PRIMER3 PLUS y se estableció la condición deproducir un amplicón en el rango de 70 a 250 pb. La extracción del ADN genómico se realizó con el kit GenElute™ Plant GenomicDNA Miniprep (SIGMA) a partir de hojas de brotes de Yerba Mate. La integridad de las muestras de ADN "total" obtenido se evaluópor electroforesis en un gel de agarosa 0,8% y tinción con el colorante GelGreen® (Biotium®). El ADN presente en las muestras secuantificó por absorción a 260 nm en un equipo NanoDrop (Thermo). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando los primersdiseñados sobre la región adyacente a los microsatélites seleccionados. Cada mezcla de reacción contenía 0,5 µg de ADN, 300 nMdel par de cebadores correspondiente, 1 µl de mezcla de nucleótidos (dNTPs 10 mM c/u), 1 Unidad de ADN polimerasa GoTaq®, 5µL de buffer de reacción GoTaq® (Promega Corp.) y agua para un volumen final de 25 µl. Las amplificaciones se realizaron en untermociclador IVEMA T18 con un programa de desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min y 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55°C durante 1 min y 72 °C por 1 min. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa 1,5% yluego teñidos con GelGreen® (Biotium®) se visualizaron en un transiluminador de luz azul Safe Imager™ (Invitrogen). Seidentificaron 353.088 SSRs y 1.704.005 iSSRs en las secuencias del genoma de Ilex paraguariensis. Entre los SSRs, los motivosrepetitivos más abundantes en el genoma fueron: el mononucleótido A (40,54%), los dinucleótidos AG (19,30%), AT (12,47%), AC(8,32%), el mononucleótido C (3,72%), los trinucleótidos ACC (3,14%), AAG (2,27%), AAT (2,22%), AAC (0,55%) y el tetranucleótidoAAAT (1,59%). Además, se observó que 33.398 SSRs, se encuentran próximos entre sí, y conforman 16.170 microsatélitescompuestos (cSSRs). A partir de la identificación precisa del loci donde se encuentran estos SSRs, se desarrollo un protocolo dePCR, que permite la amplificación de manera individual de 9 microsatélites perfectos. El desarrollo de estos marcadores específicospara la Yerba Mate permitirá realizar estudios de polimorfismo genético y de diversidad en esta especie, lo que será de granimportancia para su conservación y para su uso en programas de mejoramiento genético. Además, la metodología utilizada en estetrabajo podrá ser adaptada y aplicada en la búsqueda de microsatélites en otras especies cercanas de Ilex. La transferibilidad demicrosatélites entre especies relacionadas está permitida por la naturaleza homóloga de la secuencia de ADN en las regionesflanqueantes de microsatélites.