UN MÉTODO AUTOGRÁFICO MEJORADO PARA UNA DETECCIÓN RÁPIDA DE INHIBIDORES DE α-GLUCOSIDASA BASADO EN LA INMOVILIZACIÓN EN GELES

CAPOZZA, GIULIANA P.; SALAZAR MARIO O.; RAMALLO, I. AYELEN; FURLAN RICARDO L. E.

Rosario

Congreso; XXIV Congreso y XLII Reunión Anual SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO; 2023

SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO

Los métodos autográficos, al combinar separación cromatográfica con determinación de actividad in situ, permiten la visualización en una placa del o los constituyente(s) activo(s) presentes en mezclas facilitando el aislamiento de los mismos.1 La α glucosidasa (α glu) es un blanco terapéutico importante para la diabetes tipo 2 y las infecciones virales.2 En 2009 se reportó el primer ensayo autográfico para la detección de inhibidores de α glu.3 Seguidamente, se ha replicado esta metodología con mínimos cambios. El objetivo de este trabajo es optimizar un nuevo ensayo autográfico para detectar inhibidores de α glu. Para tal fin, se consideró la influencia de diferentes variables sobre la intensidad del color obtenido, incluyendo: concentración de sustrato (2-naftil-α-D-glucopiranósido, S) y revelador (fast blue, R), temperatura, tiempo de incubación, solución tampón (tris, fosfato y acetato) y valor de pH (entre 5 y 8). Luego, se adaptó el ensayo a un formato gel (agar o carbopol) evaluando diferentes protocolos con el objeto de obtener la mayor sensibilidad posible utilizando el inhibidor de referencia acarbosa. Se observó que la prueba es sensible al tipo de buffer y al valor de pH, al tiempo de incubación, a las concentraciones y orden de incorporación de reactivos. La inmovilización en gel permitió determinar de manera precisa la cantidad de enzima por cm2 que se incorpora dando una visión más cuantitativa respecto a los métodos reportados hasta el momento. El protocolo optimizado alcanzó un límite de detección de 0,03125 μg de acarbosa. Finalmente, se aplicó el ensayo para revelar la presencia de inhibidores en un extracto metanólico de Ilex paraguariensis A. St.-Hil. Con el mismo, es posible detectar inhibidores de α-glu presentes en matrices complejas, logrando identificar al ácido clorogénico como uno de los principales responsables de la actividad de esta mezcla. Finalmente, y considerando que los reactivos empleados pueden sufrir reacciones secundarias que resulten en falsos positivos, se desarrolló un ensayo control análogo al autográfico en el cual se suprime el agregado de α glu.