Evaluación de la capacidad neutralizante de nanomicelas de soluplus® asociadas a igg o fragmentos fab sobre la citotoxicidad de la toxina shiga tipo 2

GIRON DANIEL; FERNANDO GOMEZ; AMARAL MARÍA MARTA; LUZ DANIELA; ENRIQUE IZABELLA; CRISTINA IBARRA; PIAZZA ROXANE M F; CHIAPPETTA DIEGO; MORETTON MARCELA; SACERDOTI FLAVIA

Buenos Aires

Workshop; Fronteras en Nanobiotecnología II; 2022

Facultad de Farmacia y Bioquímica-UBA

La toxina Shiga tipo 2 (Stx2) es el principal factor de virulencia de Escherichia coli productor de toxina Shiga(STEC) y es responsable de desencadenar el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH). Dado que el SUH aún nodispone de un tratamiento específico, proponemos que nanomicelas (NM) acopladas a anticuerpos, puedenser una buena herramienta como tratamiento preventivo al aumentar la biodisponibilidad y reducir la degradación sistémica del componente bioactivo. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y caracterizar NM deSoluplus® acopladas a IgG o fragmentos Fab recombinantes contra la toxina Shiga tipo 2 (Stx2) y compararsu capacidad neutralizante de la toxina in vitro. Las IgG anti Stx2 (IgG-Stx2) se purificaron de calostro bovinohiperinmune y los fragmentos Fab (Fab-Stx2) específicos se obtuvieron por tecnología phage display y sepurificaron por columna de afinidad. Las NM de Soluplus® se prepararon al 5% en PBS 1X en agitación por24 h a temperatura ambiente. El acoplamiento a las NM con las IgG (NM-IgG-Stx2 o NM-IgG-Control) o Fab(NM-Fab-Stx2) se realizó agregando los anticuerpos en las relaciones molares de 1:100 (NM:IgG) y 1:240(NM:Fab) con agitaci[on vigorosa. Además, se caracterizó la morfología y el diámetro hidrodinámico de lasNM con y sin anticuerpos mediante microscopia electrónica de trasmisión (MET) y dispersión de luz dinámica(DLS). Para los ensayos de neutralización de Stx2 se realizaron diluciones seriadas al medio de las NM-IgGControl, NM-IgG-Stx2, NM-Fab-Stx2, IgG-Stx2 y Fab-Stx2 en medio de cultivo (MEM) donde se coincubaroncon una CD50 de 4ng/ml de Stx2 por 30 minutos. Luego, la mezcla se colocó sobre células Vero por 72 hs yfinalmente se calculó el % de viabilidad celular con resazurina. Los análisis de MET mostraron una morfologíacircular en las NM con un diámetro aproximado de 100 nm, cuyo tamaño y morfología se conservaron luegode su asociación con las IgG. Mediante la técnica de DLS se observó un diámetro hidrodinámico sin diferencias estadísticas significativas entre las NM y las NM-IgG-Stx2, NM-IgG-Control y NM-Fab-Stx2 (71,30± 2,10; 92,38 ± 18,51; 111,8 ± 32,49; 115,7 ± 56,00 respectivamente), demostrando un buen acople entre lasNM y los anticuerpos. Las NM no mostraron citotoxicidad a ninguna de las diluciones utilizadas sobre lascélulas Vero. Por otra parte, las NM-IgG-Stx2 mantuvieron la capacidad neutralizante de manera dosis dependiente sobre Stx2 con respecto a IgG-Stx2 (ANOVA, p> 0,05). Por otro lado, las células Vero tratadas conlas NM-Fab-Stx2 tuvieron una viabilidad menor (una diferencia de viabilidad en promedio 24% considerandotodas las diluciones realizadas, ANOVA, p< 0,05) con respecto a las tratadas con Fab-Stx2. Los resultadosobtenidos muestran que la asociación de las NM de Soluplus® con las IgG bovinas mantiene la propiedad deneutralización de los anticuerpos contra Stx2. Sin embargo, al acoplar las NM Soluplus® a los fragmentosde Fab no se conservaron al 100% sus propiedades neutralizantes contra la toxina. Esto abre la perspectivade continuar el estudio hacia una mejora en el entendimiento de la asociación de los anticuerpos a las NMde Soluplus®.