“Producción de MARRUBIINA por tricomas de hojas de Marrubium vulgare alimentadas con [2-3H]-GGPP”

PICCOLI P.

cordoba

Congreso; I Reunión de Biotecnología Aplicada a Plantas Medicinales y Aromáticas; 2006

Hojas de Marrubium vulgare de 25 días se cosecharon, maceraron con agua destilada, en hielo, por 1 h. Se utilizó un disruptor de células (Bead beater, biospec Products, Bartlesville, OK). La cámara de 300 ml del disruptor se llenó con 20-30 g de hojas, 100 g de perlas de vidrio, resina XAD-4 (1g/planta) y Buffer de Aislamiento Celular (BAC) conteniendo 25 mM Hepes ajustado a pH 7.3 con KOH suplementado con 200 mM de sorbitol, 10 mM sacarosa, 5mM ditioeritritol, 10 mM KCl, 5mM MgCl, 0.5 mM fosfato de potasio, 0.1 mM PPi, 0.6 % (P/V) metilcelulosa y 1% (P/V) polivinilpirrolidona (PVP3) y con rotor a 80 volt. Las hojas se sometieron a 2-4 pulsos de 1 min. a 4ºC y se aplicó frío 30 entre cada pulso. El contenido se filtró con trama de nylon de 350 μm para remover el material vegetal, la resina y las perlas de vidrio. Al material vegetal se le incorporó BAC, se agitó y se filtro como se hizo anteriormente. Al último filtrado, se lo pasó por tramas de 105 μm y 20 μm dos veces para remover restos tisulares y para mejorar el aislamiento de las células glandulares (40-60 μm de diam). Posteriormente, se las contó en hematomicrómetro. El recuento osciló en 5.105 -1.106 células tricomas. tejido vegetal-1. Células secretoras de tricomas de hojas de 25 días de Marrubium vulgare (5.105 -1.106 células) se suspendieron en BACM (3 ml de buffer), suplementado con 0.8 mM MnCl, 1.5mM NADH2, 1 mM NAD+, 3mM ATP, 3mM ADP y 1mM CoA (Gershenzon et al, 1992) y se incubo con diferentes sustratos [2-3H]GGPP a Temperatura Ambiente 3 h, bajo burbujeo y agregado de pentano para evitar la posible fuga de monoterpenos volátiles que se hubiesen formado. Después de la incubación, se removió la capa de pentano y la muestra se pasó por una columna corta de MgSO4 anidro. La suspensión acuosa se extrajo dos veces con 1 ml de dietil-eter y a posterior la fase etérea se pasó por columna corta de MgSO4. Para la cuantificación radioactiva: se tomó una alícuota del extracto orgánico, se suspendió en una solución de 30% (v/v) etanol en tolueno con 0,4% (p/v) Omnifluor (DuPont) y se determinó radioactividad (dpm) mediante un contador de centelleo (Packard TricCarb 460D). El extracto orgánico remanente se concentro bajo N2 para análisis posteriores (GC-FID, GC-MS).