EVALUACIÓN DE APTÁMEROS ESPECÍFICOS CONTRA LA PROTEÍNA DE LA NUCLEOCÁPSIDE (N) DE SARS-COV-2 PARA EL DESARROLLO DE UN TEST RÁPIDO DE DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN

GARCÍA REY, J.; CERRI, A.; CAVATORTA, A.L; CHOUHY, D.; BOLATTI, E.; GIRI, A.

Encuentro; LIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología,; 2023

SAV-AAM

Introducción: Desde la identificación del SARS-CoV-2, se han intensificado los esfuerzos pordesarrollar pruebas diagnósticas que permitan una detección temprana de la infección. Los test dediagnóstico en el punto de atención son los más utilizados para campañas de testeo masivodebido a su rapidez, sencillez, fácil estandarización, buena correlación con la qRT-PCR y elevadovalor predictivo positivo. La mayoría de estos test disponibles en el mercado utilizan anticuerposmonoclonales (AcM). Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra capaces deunirse con alta afinidad y especificidad a una amplia gama de moléculas, además su producciónrequiere una infraestructura sencilla y económica en comparación con los AcM.Objetivo: Evaluar la capacidad de unión de cinco aptámeros reportados en bibliografía para serutilizados como sensores moleculares en el desarrollo de un test rápido de detección de antígenosde COVID-19.Metodología: La expresión de la proteína N se realizó a partir de plásmidos sintéticos conteniendolas secuencias de la variante Ómicron de SARS-COV-2 con condiciones de inducción optimizadas:0,5 mM de IPTG a 37°C por 4hs. La intensidad de fluorescencia del complejo Aptámero-Proteína semidió con citometría de flujo, con estos valores se calculó la constante de disociación (Kd) y serealizaron pruebas de competencia. Se evaluaron concentraciones crecientes de los aptámeroshasta alcanzar la saturación para definir las relaciones óptimas de Aptámero-nanopartículas deoro (Apt/AuNP), que servirá como revelado en las pruebas, y de Estreptavidina-Aptámero(StV/Apt) para su inmovilización en la línea de test.Resultados: Se seleccionaron 3 aptámeros que presentaron mayor afinidad a la proteína N: A-48(kd=76nM) A-61 (kd= 22,3nM) y A-15 (kd=20,8nM) y se corroboró, mediante los análisis decompetencia, que se unen a regiones diferentes de la proteína N.El aptámero A-48 presentó la menor concentración de saturación para ser conjugado con AuNp(10 nM) y se seleccionó como conjugado Apt/AuNp para el sistema de revelado. Por otro lado, seevaluaron concentraciones crecientes de Stv (10 ng/μl, 100 ng/μl, 500 ng/μl) en membranas denitrocelulosa, manteniendo la relación StV/Apt (A-15 o A-61) óptima, y se analizaron diversasconcentraciones de proteína N (10 μg/ml , 5 μg/ml, 2 μg/ml) y GST (5 μg/ml) como controlnegativo. Estos ensayos permitieron determinar que nuestro sistema detecta hasta 5 μg/ml deproteína N en las condiciones: 500 ng/μl de Stv, 460 nM de A-61 o A-15 inmovilizada y unaconcentración final de A-48/AuNp de 1,3 nM.Conclusión: Los aptámeros seleccionados presentan afinidades adecuadas para su incorporaciónen un ensayo de cromatografía lateral para el diagnóstico de SARS-CoV-2. Las pruebas realizadascon nuestro sistema permitieron detectar la proteína N en membranas de nitrocelulosa. Secontinúan optimizando las condiciones para mejorar el límite de detección del ensayo y avanzaren el desarrollo de tiras reactivas.Financiamiento: Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación de la Provincia de Santa Fe (DTT2021).