Colección de Campylobacter fetus spp en un laboratorio de bacteriología veterinaria

GARCÍA, JUAN AGUSTÍN; MENDEZ, MARIA ALEJANDRA; MORSELLA, CLAUDIA; FIORENTINO, MARÍA ANDREA; CRAVERO, SILVIO; FARACE, PABLO; VELILLA, ALEJANDRA; MALENA, ROSANA; GIOFFRÉ, ANDREA; FERNANDO PAOLICCHI

Encuentro; XXIII REUNIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA DE LA AAVLD; 2021

Las colecciones de cultivos microbianos permiten la conservación de los recursos genéticos y de la biodiversidad de cada región o país. Estas colecciones pertenecen a entidades donde se realizan actividades cuya finalidad es obtener, clasificar, estudiar, preservar y documentar de forma completa y accesible microorganismos de interés, generando información de relevancia en diferentes áreas. El objetivo primario de una colección de cultivos microbianos es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfológicos, fisiológicos o genéticos. Nuestro Laboratorio Veterinario de la EEA INTA Balcarce cuenta con una colección de más de 2000 especímenes bacterianos de diferentes géneros y especies, con cepas de referencia, entre ellas, de Campylobacter fetus aisladas de secreciones genitales y fetos bovinos. El género Campylobacter comprende 20 especies y subspecies y es reconocida como un patógeno importante en salud veterinaria y salud pública. Particularmente, la especie C. fetus, incluye las subspecies C. fetus fetus (Cff), C. fetus venerealis (Cfv) y C. fetus venerealis biovar intermedius (Cfvi), es una de las principales causas de infertilidad, reducción de las tasas de preñez y abortos en bovinos1. El objetivo de este trabajo es divulgar la colección de Campylobacter fetus (CCf) del Laboratorio de Bacteriología de la EEA INTA Balcarce, como miembro de la Federación Latinoamericana de Colecciones de Cultivos (FELACC) e integrante de la Red de Recursos Genéticos del INTA.Materiales y MétodosLa CC se inició en 1989 y cuenta con 160 cepas de C. fetus aisladas de bovinos, hasta 2018. Las cepas son originarias de diferentes casos de diagnóstico de enfermedades reproductivas en bovinos en la Argentina. Las muestras de los casos correspondieron a rodeos de establecimientos ganaderos con bajo rendimiento reproductivo e incluyeron mucus cervico vaginal (MCV) de vacas/vaquillonas y esmegma prepucial (EP) de toros recolectadas en medio de transporte Cary Blair, refrigerados y entregados al laboratorio dentro de las 2 a 36 horas posteriores a la recolección. También, a partir de la necropsia de fetos abortados, correspondieron a muestras de pulmón, contenido abomasal y placenta. Las muestras de MCV se sembraron en agar semisólido de Brucella (ABS) con antibióticos y se incubaron durante 48 horas a 37° C en condiciones microaerófilas (90% H2, 5% O2 y 10% CO2). A partir de las 48h el anillo de crecimiento superficial fue inoculado en medio Agar Skirrow (ASK). Las placas se incubaron a 37°C en atmósfera microaerofílica y se observaron cada 48h durante 7 a 10 días.Las muestras fetales y de EP se inocularon en ASK y se incubaron en las mismas condiciones de temperatura y atmósfera que las de MCV. Las colonias con morfología compatible con C. fetus (convexas, con bordes definidos, brillantes y con tonalidad rosa translúcida), fueron observadas en un microscopio de contraste de fases para verificar la morfología y la motilidad característica del género Campylobacter (movimiento espiralado). Las colonias compatibles con C. fetus se inocularon en tubos de medio Kligler en pico de flauta para determinar la especie de acuerdo con la actividad de la enzima catalasa (positiva) y la producción de H2S (negativa). La subespeciación se determinó mediante pruebas bioquímicas: resistencia a la glicina, producción de sulfuro de hidrógeno en medios sensibles con tiras de acetato de plomo, reducción de nitratos en medios de agar selenito de sodio (ASe) y supervivencia en cloruro de sodio. Brevemente, 1) Cfv fue identificado cuando no se presentó producción de H2S, no se observó tolerancia a glicina 1%, ni presentó crecimiento en agar selenito de sodio; 2) Cfvi se clasificó por su tolerancia a glicina 1%, crecimiento en 2 de 5 estrías en ASe y producción leve de H2S; 3) Cff se determinó por su tolerancia a glicina 1% o mayor, crecimiento de 5 estrías en ASe y producción marcada de H2S.Todos los aislamientos de la CCf se conservaron en nitrógeno líquido (-196°C) y en ultrafrío (-80°C), como método de respaldo, utilizando un medio crioprotector a base de caldo tripticasa soja, glicerina y suero equino inactivado.ResultadosEl 94% de las cepas fueron aisladas de establecimientos ganaderos de la provincia de Buenos Aires, el resto correspondieron a las provincias de Santa Fé, La Pampa y Córdoba. De los 160 aislamientos, 108 (67.5%) fueron de muestras de fetos, 41 (25.5%) de MCV y 11 (7%) de EP. De las muestras de fetos 48 (44.5%) aisladas de pulmón, 55 (51%) de líquido de abomaso y 5 (4.5%) de placenta. La clasificación de subspecies dio como resultado 122 (76%) cepas de Cff, 16 (10%) Cfv, 8 (5%) Cfvi, mientras que en 14 (9%) especies identificadas como C. fetus no se realizó clasificación de subespecie. También se caracterizaron por técnicas moleculares y se secuenciaron completamente más de 50 cepas formando parte de referencias y bancos internacionales de referencia 2, 3, 4. Los genomas se encuentran disponibles en el GenBank.Discusión y ConclusiónEn la presente CCf la subespecie Cff fue significativamente más aislada, en contraste con la bibliografía donde Cfv es considerada la subespecie de importancia sanitaria y epidemiológica para bovinos. Estos aislamientos de Cff provienen de abortos esporádicos, mientras que los aislamientos de placenta son reducidos debido a la baja remisión de este tipo de muestras, no existiendo diferencias significativas entre la recuperación desde pulmón o abomaso. La recuperación de cepas de secreciones genitales resulto baja ya que no es común el diagnóstico por cultivo de las mismas, asociado a dificultades desde el momento del muestreo y el arribo al laboratorio. La importancia estratégica de esta CCf se centra en mantener este material biológico para describir la biodiversidad regional, uso como herramienta innovativa de diagnóstico, de nuevos inmunógenos, controles de laboratorios y centro de referencia. Además su utilización se manifiesta importante para estudios sobre modelos de infección experimental en animales, investigaciones sobre la interacción huésped-patógeno y evaluación de características bioquímicas y genéticas que podrían influenciar la capacidad de colonización y virulencia, así como en la validación de pruebas moleculares para diagnóstico en diferentes muestras bovinas. La CCf funciona como una biblioteca de material microbiano patógeno vivo, sostenible y estable pues actúa como repositorio de este género, buscando proporcionar herramientas para la enseñanza, la investigación y desarrollo de técnicas diagnósticas y estrategias vacunales con el surgimiento de nuevas cepas. El mantenimiento de la CCf motiva a realizar investigaciones que permitan nuevas tecnologías para control de enfermedades reproductivas5. Los mayores porcentajes de aislamiento de Cff de muestras reproductivas nos sugieren una importante participación de esta subespecie en el proceso colonización, virulencia y patogenicidad en el aborto, pero también como importante patógeno en el proceso de la infección venérea en bovinos.