DESARROLLO DE UN ENSAYO FUNCIONAL IN VIVO USANDO EL MODELO DE PEZ CEBRA PARA EVALUAR LA PATOGENICIDAD DE DOS VARIANTES IDENTIFICADAS EN EL GEN IGF1 EN PACIENTES CON TALLA BAJA.

RECALCATTI, MACARENA; SALATINO, LUCIA; FERNÁNDEZ, MARÍA CELIA ; MARTIN, AYELÉN ; KESELMAN, ANA ; DOMENÉ, HORACIO; PENNISI, PATRICIA ; PLAZAS, PAOLA; DOMENÉ, SABINA

Congreso; 1er encuentro Zebrafish en Red Argentina ZebRA2023; 2023

El factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF1) se encuentra altamente conservado en vertebrados y juega un rol central en el crecimiento pre- y postnatal. Es un factor proliferativo y de diferenciación celular que se expresa en casi todos los tejidos, predominantemente en el hígado bajo el estímulo de la hormona de crecimiento (GH). La deficiencia de IGF1 en humanos por variantes génicas homocigotas de pérdida de función se caracteriza por retraso de crecimiento intrauterino y postnatal, en algunos casos acompañado de sordera sensorial y retardo mental. Se han caracterizado 7 variantes génicas en este gen que resultan en deficiencia de IGF1. Aunque se ha realizado la caracterización funcional in vitro de la mayoría de estas variantes, resulta útil contar con un modelo animal para realizar estudios funcionales in vivo para determinar la patogenicidad de las mismas. Los ensayos funcionales usando al pez cebra como biosensor son ensayos de rescate usando morfolinos (MO) o ensayos de sobreexpresión del mRNA humano wildtype (WT) y variantes.Nuestro objetivo es desarrollar un ensayo funcional para determinar la patogenicidad de dos variantes génicas (p.Ser35Cys y p.Tyr60His) identificadas en IGF1 en dos pacientes utilizando como modelo animal, al pez cebra. Aunque ambos pacientes comparten el retraso severo en el crecimiento, la paciente con la variante p.Ser35Cys presenta un desarrollo cognitivo cercano al límite normal y ausencia de sordera y el paciente con la variante p.Tyr60His presenta un retraso en el desarrollo cognitivo y sordera bilateral.Realizamos un ensayo de knockdown con un MO de igf1 y un ensayo de sobreexpresión con los mRNAs de IGF1 humano WT y variantes, microinyectando estas moléculas en embriones fertilizados y observando el fenotipo obtenido a las 48 horas post fertilización (hpf). Las variantes fueron introducidas en el cDNA completo de IGF1 humano por mutagénesis sitio-dirigida. Para generar el mRNA, los cDNAs fueron linealizados y transcriptos in vitro con el Mmessage Mmachine T7 Transcription Kit.Los resultados preliminares muestran que el knockdown de igf1 con MO resulta en embriones con malformaciones del desarrollo que incluyen: edema pericárdico (28%), edema del saco vitelino (36%) y malformación de la cola (46%). Por otro lado, la sobreexpresión de mRNA IGF1 humano WT resulta en embriones con: ciclopía (37,1%), edema pericárdico (51,4%), edema del saco vitelino (54,3%) y malformación de la cola (42,9%). Finalmente la sobreexpresión de las variantes p.Ser35Cys y p.Tyr60His resulta en embriones que presentan: ausencia de ciclopía, edema pericárdico (6,9% y 0%), edema del saco vitelino (17,2% y 4,5%) y malformación de la cola (10,3% y 0%).En conclusión, nuestro estudio preliminar demuestra la naturaleza patogénica de las dos variantes de IGF1 humano. Sin embargo la sobreexpresión de las variantes logró reproducir en menor grado el fenotipo de los embriones inyectados con el mRNA IGF1 WT. La variante p.Ser35Cys retuvo cierto grado de actividad biológica, mientras que la variante p.Tyr60His resultó prácticamente inactiva. Resta realizar el ensayo de rescate con los mRNAs WT y variantes para evaluar si logran rescatar el fenotipo observado con el MO.