ELABORACIÓN DE UNA MATRIZ CROMATOGRÁFICA PARA LA PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS

VELASQUES ESPINOZA, LESLY; VERA, ANTONELLA; SOTO ESPINOZA, SILVIA; KIKOT, PAMELA ALEJANDRA; GRASSELLI, MARIANO

QUILMES

Jornada; V Jornadas de Investigadores en Formación en CyT UNQ; 2023

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES

La proteína A es de gran interés en la purificación de anticuerpos (Ig) dada su estabilidad química y una muy alta afinidad a la región Fc. Está compuesta por cinco dominios con un sitio de unión cada uno, sin embargo, sólo un par de ellos pueden interaccionar simultáneamente por impedimento estérico. En este trabajo se presenta la elaboración de una matriz cromatográfica para la purificación de Ig. El proceso completo de elaboración de la matriz se realizó en 3 etapas: 1) Producción del ligando de afinidad recombinante basado en proteína A Estafilocócica; 2) Modificación de la matriz con el ligando de afinidad; 3) Evaluación de la capacidad estática y dinámica de matriz. Los resultados obtenidos permiten seguir optimizando la modificación de la matriz.La proteína AviPure (AP) [1] recombinante está compuesta por dos de los cinco dominios de la proteína A Estafilocócica y una etiqueta de His(4)-Cys(2) para su purificación e inmovilización en soportes sólidos [2]. AP se expresó en E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+) utilizando un cultivo batch alimentado y un biorreactor de 5 L (BIOSTAT A plus, Sartorius). Luego se realizó la lisis celular por ultrasonido (SONICS vibra cell) y la purificación por cromatografía con Ni-IDA (IMAC sepharose FF, Cytiva) y el sistema AKTA prime plus. La proteína fue acondicionada por exclusión molecular, liofilizada y caracterizada por SDS-PAGE. Para la elaboración de la matriz de afinidad se emplearon los soportes Eupergit C (Degussa) (activada con grupos epóxidos) y Sepharose (activada por bromación). Se caracterizó la reacción de ligación con los grupos sulfhidrilos de la Cys mediante microscopía de fluorescencia (Cytation) utilizando como modelo proteína verde fluorescente (GFP) con la misma etiqueta que AviPure. Finalmente se modificaron las matrices con AviPure y examinó la capacidad de unión a Ig (dinámica y estática) de las resinas producidas.Se logró obtener 3,4 g de AviPure puro. El ensayo de inmovilización de GFP sobre las matrices sólidas demostró la eficiencia de la reacción de ligación proporcionada por la etiqueta de Cys. La unión de AviPure a los soportes seguida por las determinaciones de capacidad de adsorción de inmunoglobulinas mostró la efectividad de las matrices elaboradas. En el caso de Eupergit C (un soporte usualmente usado para inmovilizar enzimas) la capacidad de unión de Ig fue baja, por lo que la Sepharosa es una matriz de mejores características.[1] Kangwa, M; Yelemane, V; Polat, A. N; Gorrepati, K. D. D; Grasselli, M. & Fernández-Lahore, M. 2015, High-level fed-batch fermentative expression of an engineered Staphylococcal protein A based ligand in E. coli: purification and characterization. AMB Express, 5(1), 1-10.[2] Kikot, P. Polat, A.; Achilli, E; Fernandez Lahore, M; & Grasselli, M. 2014, Immobilized palladium (II) ion affinity chromatography for recovery of recombinant proteins with peptide tags containing histidine and cysteine. Journal of Molecular Recognition, 27(11), 659-668.