Identificación y purificación de D-tagatosa a partir de mezclas complejas de azúcares

CROATTO, FIORELA; HISSA, DENISE C.; GONÇALVES, LUCIANA R. B.; MAMMARELLA, ENRIQUE J.; MANZO, RICARDO MARTÍN

Buenos Aires

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de Alimentos XVIII CyTAL® 2023; 2023

El lactosuero es un líquido amarillento que se obtiene durante la fabricación del queso en la etapa de coagulación. Los componentes disueltos en su mayoría son proteínas, azúcares y sales. Debido a su pH y composición, el suero se deteriora rápidamente y no puede ser descartado directamente como efluente sin tratamiento por problemas de fermentación y, en consecuencia, de contaminación ambiental. No usar el lactosuero como alimento o aditivo es un enorme desperdicio por ser un producto nutricionalmente rico.El desarrollo de compuestos de alto valor agregado a partir de la lactosa posibilitará un aprovechamiento integral, no solo económico, del lactosuero. Las sustancias tecnológicamente más relevantes derivadas de la lactosa son: D-galactosa (D-gal), lactulosa, lactitol, lactosacarosa, galacto-oligosacáridos (GOS), D-tagatosa (D-tag), entre otros. De la totalidad, la D-tag es uno de los derivados con más mercado y posibilidades de desarrollo a largo plazo, siendo nuestro producto de interés.Mediante un proceso de hidrólisis, la lactosa se descompone en D-glucosa y D-gal, esta última se somete isomerización vía enzimática (L-arabinosa isomerasa) para obtener D-tag. Para que este proceso pueda adaptarse a un posible uso industrial debe lograrse una purificación adecuada de la D-tag, ya que se obtiene como mezcla con los sustratos de partida. Para lograrlo, en este trabajo se hizo énfasis en su purificación empleando técnicas de cromatografía iónica aplicando el modo de operación por intercambio de ligandos. Simultáneamente, se diseñó y validó una metodología de determinación de sacáridos por cromatografía gaseosa y se la comparó y correlacionó con métodos de análisis colorimétricos usualmente empleados tales como Dische y Borenfreund, Kulka y Selliwanoff.La enzima se obtuvo a partir de una cepa recombinante de Escherichia coli BL21 Star (DE3). Se evaluó la actividad enzimática y se optimizó el ensayo testeando distintos volúmenes, tiempos y concentraciones de los reactivos. Las metodologías colorimétricas se optimizaron y ensayaron en cuanto a su eficacia y cuantificación de D-gal y D-tag, observando que la técnica del carbazol-ácido sulfúrico-cisteína arrojó los mejores parámetros analíticos (sensibilidad y límite de detección, fundamentalmente). Los azúcares también se evaluaron por cromatografía gaseosa; para ello se estudiaron tres mezclas diferentes de agentes derivatizantes de trimetilsililéter, donde aquella conocida comercialmente como “Silan-sterol” fue la que arrojó los mejores resultados. Así, se apreció una excelente correlación entre ambas estrategias de cuantificación.Se realizaron avances en la purificación de la D-tag empleando una resina de estireno divinil benceno funcionalizada con el ion calcio. La cromatografía reveló picos de elución bien separados, aunque parcialmente solapados. El análisis de dichas fracciones reveló que fue posible recuperar el 92±5% de la D-tag con una pureza estimada del 30±3%. Estos resultados son promisorios dado que la D-tag se encontraba en una proporción del 5% en relación al total del sustrato, D-gal. Finalmente, el rendimiento de conversión de la enzima L-arabinosa isomerasa resultó ser del 40±3%, el cual se encuentra dentro del rango de transformación obtenido por las enzimas provenientes de microorganismos mesófilos.