Unión del catión calcio a la fosfatasa alcalina intestinal de la rata. Modificación de la cinética enzimática y su estructura molecular.

BRUN LUCAS; BRANCE LORENA; RIGALLI ALFREDO; PUCHE RODOLFO

Buenos Aires

Congreso; XXIII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral.; 2005

Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral

UNIÓN DEL CATIÓN CALCIO A LA FOSFATASA ALCALINA INTESTINAL DE LA RATA.  MODIFICACIÓN DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA Y SU ESTRUCTURA MOLECULAR. Lucas R. M. Brun, María L. Brance, Alfredo Rigalli, Rodolfo C. Puche. Laboratorio Biología Ósea. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina. La fosfatasa alcalina intestinal (FAI) es una fosfomonoesterasa que actúa sobre una gran variedad de moléculas fosforiladas. Su rol en la absorción intestinal de calcio (Ca++) es parcialmente conocido. Hemos demostrado que la FAI es inhibida en forma no competitiva por el Ca++ y que cuando la concentración Ca++ es menor a 10 mM la enzima liga 7.8±4.4 iones Ca++/mol de FAI con una constante de afinidad de 19.1±8.4 mM-1, siendo los sitios independientes y de igual afinidad. Si la concentración de Ca++ es mayor a 20 mM el mencionado modelo no es aplicable y la enzima fija 6300±1300 iones/mol de proteína. La medida de actividad de FAI en solución muestra un efecto bifásico dependiendo de la concentración de calcio investigada. Cuando la [Ca++]<10 mM la actividad de FAI se incrementa en función de la concentración de Ca++ (r= 0.95 p<0.01). Si [Ca++]>20 mM dicha relación se invierte (r= -0.70 p<0.05). Experimentos de polarización de fluorescencia de FAI en presencia de Ca++ sugieren que el catión produciría agregación molecular de la enzima. El objetivo de este trabajo fue investigar cambios en la actividad y el peso molecular de la enzima en presencia de Ca++ 50 mM. En todos los experimentos se utilizó FAI purificada del intestino de ratas línea IIM/FcM sublínea “m” adultas. La enzima fue incubada con Ca++ 50 mM durante 5 minutos en los casos requeridos. Se realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 5% con SDS (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión molecular con la enzima en presencia y ausencia de Ca++ 50 mM. Para los Western blots y dot blots se utilizó un anticuerpo de cobayo anti-FAI de rata, anti-IgG de cobayo conjugado con peroxidasa y 3-amin-9-etilcarbazol (AEC) como sustrato. En solución, la actividad de FAI se determinó utilizando como sustrato p-nitrofenilfosfato. En membranas de nitrocelulosa la actividad de FAI se detectó utilizando 5-Br-4-Cl-3-indolil fosfato (BCIP). Se realizaron los siguientes experimentos: 1- SDS-PAGE en presencia de 45Ca++: Se detectaron dos bandas con radioactividad. Una de bajo y otra de alto peso molecular. El tratamiento con Ca++ 50 mM produjo un incremento de la radioactividad asociada a la banda de alto peso molecular.   2- Cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G200 de FAI en presencia y ausencia de Ca++ 50 mM: En ambos casos se detectaron por Dot blot dos fracciones (F) de FAI con diferente  masa molecular: F1= 161±17 kDa y F2= 472±25 kDa. F1 presenta mayor actividad específica que F2. El tratamiento con Ca++ produce disminución de la cantidad de proteína de F1 y un proporcional incremento de F2. 3- Western Blot: Se detectaron dos fracciones de la enzima: F1 con actividad enzimática y F2 sin actividad. El peso molecular de las fracciones fue: F1= 168±6 kDa y F2= 425±45 kDa. Se concluye que el tratamiento de la FAI con calcio 50 mM produce agregación molecular acompañada de disminución de la actividad específica de la enzima. La importancia que la agregación molecular de la FAI simultánea con la fijación de calcio pueda tener sobre el mecanismo de absorción del catión a nivel intestinal es desconocido y requiere experimentos adicionales.