Evaluación del daño histologico producido por la toxina shiga tipo 2 purificada por cromatografiá de intercambio ionico

PRESTA, AGOSTINA; LOPEZ DIAZ, ANALIA; CELI, ANA; GIRON REYES, CLAUDIO DANIEL; SACERDOTI, FLAVIA

Buenos Aires

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Histotecnologia; 2023

La toxina Shiga tipo 2 (Stx2) producida por Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es responsable de desencadenar síndrome urémico hemolítico (SUH), una enfermedad pediátrica definida clínicamente por: anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia y falla renal aguda (1). El objetivo de este trabajo fue producir y purificar Stx2 por técnicas cromatográficas y determinar su actividad biológica a través de la evaluación del daño histológico renal producido en ratas con la intención de producir un insumo para la investigación y diagnóstico en el área de SUH en Argentina. Para ello, un lisado bacteriano de la cepa de STEC 125/99 productora de Stx2 se purificó utilizando una columna de cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones controladas. Se determinó la pureza de las fracciones obtenidas por SDS-PAGE y la presencia de Stx2 por Western blot. Luego se evaluó la actividad biológica de las fracciones que contenían Stx2 sobre células Vero y se seleccionó la fracción más enriquecida (Stx2pur) de toxina para evaluar su funcionalidad in vivo. Para ello, se inyectaron ratas Sprague Dawley con: una fracción cromatográfica sin toxina (Control), una dosis de Stx2pur diluida 1/1000 y una dosis subletal de toxina shiga comercial como control positivo (0,5 ng/g Stx2). Las ratas estuvieron 4 días bajo supervisión y al quinto día fueron sacrificadas y perfundidas con paraformaldehido 4%. Los riñones fueron extraídos para su posterior procesamiento histológico hasta la obtención de tacos parafinados y la realización de cortes de 3 µm. Los preparados fueron desparafinados e hidratados previo a ser teñidos con la técnica de PAS y H-E para ser observados y evaluados por microscopía. Mediante cromatografía de intercambio iónico se obtuvo la fracción de purificación Stx2pur en la que se confirmó presencia e identidad de Stx2 por western blot y mostró una citotoxicidad en células Vero del 100% en la dilución 1. 108. La evaluación histológica de los tejidos renales mostró que los riñones de ratas inyectadas con Stx2pur presentaron daño glomerular con necrosis, adherencias epiteliales, daño tubular con necrosis y daño de la membrana basal evaluado por la técnica de PAS. La histopatología de las ratas inyectadas con Stx2pur fue comparable al daño observado en glomérulo y túbulo por la toxina Stx2 comercial. Los riñones de las ratas Control mostraron leve daño renal fundamentalmente a nivel tubular. Los resultados obtenidos demuestran que la Stx2pur ejerce un tipo de daño histológico a nivel renal similar al de Stx2 comercial. Dado que se observó un leve daño renal en ratas inyectadas con una fracción de purificación sin Stx2 consideradas control, se propone que otros contaminantes podrían ejercer este efecto que debería confirmarse con una inmunohistoquímica para identificar la toxina en los tejidos. La fracción Stx2pur obtenida podría ser utilizada para realizar técnicas de identificación de anticuerpos anti Stx2 (Western blot) y como inóculo para modelar SUH en animales. Otros pasos de purificación serían importantes para obtener la toxina con mayor grado de pureza.