Ciclo replicativo de miembros del complejo de Encefalitis Equina Venezolana: la clave para esclarecer aspectos críticos de su patogénesis.

PIRIS FRANCO; GHIETTO LUCÍA MARÍA; GIL PEDRO IGNACIO; CONTIGIANI MARTA; PAGLINI GABRIELA

Córdoba

Congreso; XLII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL 2022; 2022

Sociedad Argentina de Virología

El complejo de Encefalitis Equina Venezolana (VEE) es uno de los serogrupos en los que se clasifican los Alphavirus del Nuevo Mundo. Son transmitidos por vectores hematófagos y causan brotes periódicos en América de Sur, en caballos y humanos. El objetivo del trabajo fue caracterizar el ciclo de replicación del virus Rio Negro (RNV) en células Vero clon 76 y ampliar los conocimientos previos sobre el virus Pixuna (PIXV). En primer lugar, se diseñó y optimizó un ensayo de rt-PCR en tiempo real (rt-qPCR) para cuantificar los genomas virales. En segundo lugar, se adaptó el RNV al cultivo mediante 10 pasajes ciegos. El último sobrenadante constituyó el stock viral que se tituló por ensayo de placa (EP). Para describir el curso temporal de la infección, se infectaron células Vero con PIXV o con RNV (MOI 0,1), se recolectaron los sobrenadantes y monocapas a diferentes horas postinfección (hpi) (2, 4, 6, 8, 12 y 24), los cuales fueron titulados por EP y rt-qPCR. Paralelamente, las monocapas celulares fueron procesadas para inmunofluorescencia (IF) y analizadas por microscopía para observar la progresión de la infección intracelular y cambios en el citoesqueleto de actina. En concordancia con los estudios anteriores para el PIXV, se observó que el intervalo de tiempo desde la infección hasta el comienzo de la fase estacionaria para el RNV es de 24 horas, representando el tiempo requerido para completar la curva de crecimiento viral. Las primeras 4 hpi corresponden a la fase eclipse, donde los viriones ingresan y se produce su desnudamiento. Desde las 4 a 24 hpi, la infección avanza hacia una etapa de crecimiento rápido llamada fase exponencial, donde se cuantificó el máximo rendimiento viral. Mediante la técnica de IF, entre las 6 y 8 hpi se observan las primeras células infectadas (10 %) para ambos virus, donde se visualizan las proteínas virales en la región perinuclear, sitio en el cual éstas son sintetizadas y procesadas. A las 12 hpi, aumenta la inmunomarcación en la región perinuclear y las proteínas virales comienzan a distribuirse en gran parte del citoplasma, para finalmente, a las 24 hpi cuando el 100% de las células están infectadas, invadirlo por completo. Además, las imágenes obtenidas muestran que la infección por RNV afecta la morfología celular, observándose un marcado efecto citopático. Esto se corresponde con una reorganización del citoesqueleto de actina, donde en células no infectadas se observan claramente las fibras de estrés, mientras que en células infectadas (12 hpi) estas fibras desaparecen y se observa un cinturón de actina en la región subcortical. Este es el primer paso en el conocimiento de la biología celular de la infección del RNV en cultivos de células Vero, además complementa resultados previos sobre el ciclo de infección del PIXV necesarios para poder desarrollar estrategias de prevención y tratamientos de enfermedades causadas por los Alfavirus del Nuevo Mundo que presentan una creciente reemergencia a nivel mundial.