Descripción comparativa de coloraciones en el ensayo de micronúcleos-citoma bucal en caninos.

CARRACEDO ROCIO TATIANA; CALIRI MARTINA NOEL; PEDROSA ANALÍA; LENTINI VALENTINI; GORLA NORA

Congreso; CONGRESO VETERINARIO DE LEÓN EN ARGENTINA; 2023

El perro es actualmente una especie sugerida para realizar estudios de toxicología genéticaen biomonitoreos sobre el efecto de la contaminación ambiental a distintos niveles deorganización biológica (Backer et al., 2001); y además, este modelo podría jugar un papelimportante en la evaluación de productos químicos, incluido fármacos y la evolución de untratamiento, con proyección aplicable al hombre. En este sentido, una de las ventajas derealizar investigación biomédica en caninos, es que estos animales de compañía y laspersonas comparten gran parte del medioambiente con los contaminantes allí presentes,hábitos, consumo de agua del mismo origen y calidad, alimentación, y existen similitudes enlas prácticas médicas y tratamientos farmacológicos. En consideración de que los epiteliosson el blanco de exposición y vía de ingreso de muchos fármacos y contaminantes, elobjetivo del estudio fue identificar las características distintivas de la coloración de Giemsa yla reacción de Feulgen, aplicadas al ensayo de micronúcleos citoma (MN- cit) bucal encélulas exfoliadas de la mucosa oral, en términos de ventajas y facilidades de uso en lapráctica veterinaria.Se realizó el análisis citológico a partir de muestras de mucosa bucal obtenida por raspajecon mini- espátulas de 6 caninos adultos sanos raza ovejero alemán de 3 a 6 años de edaddel Cuerpo de Canes “Sgto. Ramón González” de la policía de Mendoza, los cuales nohabían recibido medicación durante 2 meses previos a la toma de muestra. Las muestras sefijaron con metanol: ácido acético (3: 1) durante 10 minutos, se extendieron en portaobjetosy se dejaron secar al aire por un mínimo de 24 h. Los extendidos se colorearon con lareacción de Feulgen, según Thomas et al., 2009 con modificaciones. La observación serealizó en forma secuencial por microscopía óptica y luego por microscopía de fluorescenciamediante el uso de microscopio de epifluorescencia Nikon E200, con lámpara de vapor demercurio HB100. Posteriormente, se enjuagaron los extendidos con agua destilada y secolorearon con Giemsa (Merk) la cual se preparó al 10% en agua corriente y se colocaronlas muestras durante 9 min. Luego fueron lavadas con agua corriente y se dejaron secar atemperatura ambiente para ser observadas por microscopía óptica en un microscopio NikonEclipse E100.En un total de 2.000 células analizadas por individuo (1.000 células coloreadas con Giemsay 1.000 con reacción Feulgen), se analizaron las variables cualitativas de distincióndiferencial del núcleo y citoplasma, presencia de artificios citoplasmáticos, morfología decélulas basales y diferenciadas, coloración de células indicadoras de muerte celular: concromatina condensada, cariorrexis, cariolisis y picnosis; y coloración de células conanormalidades nucleares: micronúcleos (MN) y brotes nucleares.Una de las características únicas de la coloración Feulgen, es que es una reacción nucleardonde el ADN se observa como color rojo brillante bajo fluorescencia con un filtro rojo, loque permite distinguir límites precisos entre núcleo y citoplasma. La textura nuclear, que esesencial en la clasificación de cromatina condensada y las células cariorréxicas, se exponeen forma clara bajo la observación con un microscopio de fluorescencia, en coincidencia conThomas et al., 2009. Mediante esta reacción ADN específica, se pueden distinguir demanera más precisa las alteraciones nucleares y los MN con evidente contraste entre elnúcleo y el citoplasma por el verde brillante bajo observación con microscopio óptico (figura1), como también han reportado otros autores (Esteves et al., 2018). Esta coloración permiteexaminar de manera secuencial los extendidos citológicos, tanto por microscopía ópticacomo de fluorescencia, para confirmar las sospechas o falta de definición respecto a laclasificación celular que pudieran haber surgido durante la observación por microscopíaóptica (figuras 2, 3 y 4). Esta ventaja disminuye las probabilidades de falsos positivos, yaque no se colorean estructuras como bacterias, como sucede con la coloración Giemsa.Carracedo Rocío Trinidad (autora y presentadora)1, Ferré Daniela Marisol1,2, Caliri Martina Noel,2, PedrosaAnalía Cristina1,3, Lentini Valeria Roxana1, Gorla Nora Bibiana María1,2. 1. Laboratorio de Genética, Ambiente yReproducción, UMaza. 2. CONICET. 3. Histología y Embriología Veterinaria, Facultad de Cs. Veterinarias yAmbientales, UMaza. (E- mail: rcarracedo@profesores.umaza.edu.ar, tel: 2614191154)Además, la observación es más rápida, así como también más sencilla respecto de estaúltima coloración. La coloración Giemsa es ampliamente utilizada en citogenética por tenerafinidad a zonas ricas de Adenina y Timina en la cromatina (Wong, 2016). Es un métodorápido (15 min), sencillo de preparar al ser de un solo paso, su costo es relativamente bajo ytiene menos soporte de infraestructura en comparación con la coloración Feulgen(Dilleswari, 2018; Esteves et al., 2018; Metgud, 2017). Requiere una fijación celular de tansolo minutos. En caso de exceso en la intensidad de la coloración se puede decolorar yvolver a colorear.Se determinó que, si no se utiliza un reactivo de Schiff de excelente calidad, como unamarca de alta gama, en la coloración de Feulgen los núcleos se observan excesivamenteclaros, lo que imposibilita la distinción de algunos detalles nucleares, como los MN detamaño pequeño y grados leves de condensación de la cromatina nuclear (figuras 5 y 6).Cuando las células presentan detritus, bacterias o gránulos de queratohialina, si bien no secolorean, mediante la observación en fluorescencia pueden ser interpretados como gradosde condensación o cariorréxis según la cantidad de los mismos ya que se observan sombrasoscuras en el citoplasma. Los artefactos de la coloración, que se originan al usar un reactivode baja calidad o en malas condiciones, brillan a la fluorescencia por lo que puedenconfundirse con MN. Es un método que insume más tiempo (aproximadamente 3 a 4 h) yeconómicamente implica un gasto alto entre insumos (frascos Coplin, agua ultrapura,microscopio de epifluorescencia, cámara de extracción para manipular HCl, reactivo deSchiff y colorante verde brillante). En caso de exceso de verde brillante en el extendido, ésteno permite observar el núcleo y no se puede decolorar para volver a colorear. En Giemsa lasbacterias que contaminan el extendido se tiñen de violeta, por lo que es posible su confusióncon un MN resultando en falsos positivos al momento del análisis cuantitativo deanormalidades nucleares indicadoras de daño genético, tal como se ha reportado Esteves etal. (2018). También colorea artificios con las mismas consecuencias. La observación de losextendidos requiere de mayor tiempo. En concordancia con otros autores, se considera queel uso de diferentes coloraciones, y distintos protocolos de trabajo para una mismacoloración pueden contribuir a grandes variaciones encontradas por los diferenteslaboratorios, principalmente en relación al color y contraste (Bolognesi et al., 2013; Esteveset al., 2018; Grover et al., 2012; Pai et al., 2012 y Ramirez, 2002).Como conclusión, para realizar una evaluación del daño al material genético se recomiendarealizar un estudio citológico con la reacción Feulgen, siempre que pueda utilizarse unreactivo Schiff de excelente calidad. La coloración Feulgen presenta como desventaja querequiere de mayor tiempo y elevado costo en comparación con la coloración Giemsa.Respecto a esta última, presenta como ventaja la realización en forma sencilla en un solopaso, con una duración de 15 min, además de ser económico, a fin de realizar monitoreosque implican un análisis secuencial en el tiempo. Ambas coloraciones son útiles, además,para evaluar citotoxicidad o muerte celular en caninos.