Efecto in vitro de la preparación proteolítica del látex de Vasconcellea quercifolia (Caricaceae) sobre la coagulación sanguínea

TORRES M JOSÉ; DE ARAÚJO VIANA CAROLINA; ERRASTI M EUGENIA; NATALUCCI CLAUDIA; VIANA RAMOS MARCIO; LOPEZ LAURA

Buenos Aires

Jornada; XII Jornadas de Bioquímica y Farmacia Industrial (JorFyBI 2015); 2015

Confederación Latinoamericana para la Investigación y Producción de Medicamentos e Insumos para la Salud (CLAPROMEDIS)

IntroducciónEl desarrollo de nuevos fármacos puede lograrse a partir delestudio de sustancias contenidas en plantas y hierbas. La enorme biodiversidadde plantas que posee Argentina nos plantea la posibilidad de identificar susactividades biológicas para aplicarlas a terapéuticas de enfermedades denuestra población.En respuesta a una lesión, los frutos de Vasconcellea quercifolia (Caricaceae) responden rápidamente paradetener la pérdida de látex mediante formación de un coágulo alrededor de laherida, fenómeno similar al observado en los tejidos de mamíferos expuestos aun trauma al detener la pérdida de sangre. Durante la coagulación del látex seproduce el procesamiento de péptidos concomitantemente con la activaciónsecuencial de enzimas proteolíticas, semejante a lo que ocurre en mamíferos.Las similitudes entre ambas procesos de coagulación nos llevaron a plantear quefactores análogos pueden estar presentes en ambos sistemas y que posiblemente metabolitosvegetales que intervienen durante la cicatrización de la planta, también puedenactuar durante el proceso en mamíferos.Previamente,a partir del látex de frutos inmaduros de VasconcelleaquercifoliaA.St.-Hil, unaespecie de la familia Caricaceae que crece en Argentina, hemos obtenido unapreparación enzimática con elevada actividad proteolítica, la cual hemoscaracterizado bioquímicamente y denominado Vq. Esta preparación mostró seractiva en un amplio rango de pH (con valores superiores al 80% de la actividadmáxima entre pH 6,7 y 10,0) y presentado actividad también a pH ácido, elevadaestabilidad térmica y la actividad enzimática prácticamente no se ve afectadapor altas concentraciones salinas[1]. A partir de la preparación Vq purificamos por métodoscromatográficos siete peptidasas cisteínicas que fueron caracterizadas eidentificadas estructuralmente empleando herramientas de proteómica[2]. Materiales y Métodos Preparaciónproteolítica.  El látex fue obtenido practicando incisionessuperficiales en los frutos de V.quercifolia y recibido sobre buffer cítrico-citrato 0,1M de pH 5,6conteniendo EDTA 5mM y tetrationato de sodio 1mM. La preparación fuecentrifugada a 11500 g durante 20 min, obteniéndose un sobrenadante límpido quefue denominado Vq.Actividad Coagulante. Para losensayos se utilizó plasma sanguíneo obtenido de donantes sanos (la sangre fuerecolectada sobre citrato trisódico y centrifugada a 500g durante 15 min a temperatura ambiente). La actividad coagulantese determinó de acuerdo al procedimiento descripto por Condrea et al[3].Se colocaron 30 µl de lamuestra de V. quercifolia disuelta enbuffer Tris-HCl 10 mM de pH 7,5 conteniendo DTT 3 mM y 300 µl de plasmacitratado, luego de incubar 1 min a 37 ºC se indujo la formación del coágulopor adición de 30 µl de CaCl2 0,25 M. Se registró el tiemponecesario para la formación de un coágulo visible a partir del momento delagregado de CaCl2. Los ensayos se realizaron por triplicado, y comocontrol se reemplazó la muestra por buffer.Tiempo de Tromboplastina ParcialActivada (APTT) y Tiempo de Pro-Trombina (PT). Seemplearon kits comercial de Wiener lab. y los ensayos fueron realizadossiguiendo las instrucciones del fabricante. Previamente100 µl de plasma humanofueron incubados con 10 µl de muestra Vq disuelta en buffer Tris-HCl 10 mM depH 7,5 conteniendo DTT 3 mM, durante 2 min a 37ºC. Las determinaciones serealizaron por triplicado y como control negativo se usó el buffer.Ensayo deformación e hidrólisis de coágulos de fibrina. Elensayo fue realizado de acuerdo al método de Shivaprasad et al[4].En la cubeta del espectrofotómetr se colocaron 700 µl de solución de fribrinógeno humano (5 mg/ml) en buffer Tris HCl 10 mMde pH 7,5 y 70 µl de muestra. La formación del coágulo de fibrina (aumento de turbidez)y su hidrólisis (descenso) por las peptidasas fue seguida por medida de laabsorbancia a 540 nm durante 30 min. Como control negativo se empleó el buffer. ResultadosLapreparación proteolítica Vq logró disminuir notoriamente el tiempo decoagulación con respecto al control, siendo dicho tiempo un 75% menor para lapreparación sin diluir y un 40% menor para una dilución 1/2. Para determinar siel efecto coagulante de las proteasas es ejercido sobre la cascada intrínseca oextrínseca de la coagulación, se ensayaron el Tiempo de Tromboplastina ParcialActivada (APTT) y el tiempo de Protrombina (PT). Vq disminuyó de manerasignificativa el valor de APTT, sugiriendo una afectación del sistema intrínsecode coagulación.Por otraparte, con el fin de determinar un probable sitio de acción de las peptidasas enla cascada de coagulación se ensayó la actividad fibrinógeno y fibrinolíticamediante el análisis de formación e hidrólisis de coágulos de fibrina porespectrometría. La preparación Vq mostró que en la concentración utilizadaacorta el tiempo de formación del coágulo de fibrina (10 veces menor respecto alcontrol); pero dada su alta actividad proteolítica, posteriormente hidrolizalos coágulos de fibrina, detectándose una hidrólisis del 80% del coágulodespués de 20 minutos de contacto con la preparación Vq. Conclusiones La preparaciónproteolítica obtenida a partir del látex de V.quercifolia por un lado tiene la capacidad de actuar como un agente coagulanteal disminuir el tiempo de coagulación modificando fundamentalmente el APTT,pero también es capaz de hidrolizar coágulos de fibrina. La actividad predominantepodría ser seleccionada en función de la concentración y el tiempo de acción. Vqmuestra ser una preparación con potencial terapéutico para el desarrollo demedicamentos en el área de la investigación biofarmacéutica.[1] Torres MJ, Trejo SA, MartinMI, Natalucci CL, Avilés FX, and López LMI (2010) Purification and characterization of a cysteine endopeptidasefrom Vasconcellea quercifolia A.St.-Hil. latex displaying high substrate specificity. J Agric Food Chem 58:11027?11035.[2] Torres MJ, Trejo SA, Obregón WD,Avilés FX, López LMI and Natalucci CL (2012)?Characterization of the proteolytic system present in Vasconcellea quercifolia latex?. Planta 236:1471-1484.[3] Condrea E, Yang CC, Rosenberg P. (1983)?Anticoagulant activity and plasma phosphatidylserine hydrolysis by snake venomphospholipase A2?. Thromb Haemost 49:151?157[4] Shivaprasad HV, Rajesh R,Nanda BL, Dharmappa KK, Vishwanath BS. (2009) ?Thrombin like activity of Asclepias curassavica L. latex: actionof cysteine proteases?. J Ethnopharmacol123:106?109.