Aislamiento y caracterización de una nueva peptidasa cisteínica a patir del látex de cisteíno proteasas (St.Hil.) Hieron. (Caricaceae)

TORRES M.J., TREJO S.A., BRONSOMS S., AVILÉS F.X., NATALUCCI C.L. Y LÓPEZ L.M.I.

Elche, España

Congreso; XXIX Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biologia Molecular; 2006

Se ha seleccionado como material de estudio el látex de Carica quercifolia (St.Hil.) Hieron., (Caricaceae) especie que crece de manera silvestre en el norte de Argentina al igual que Carica papaya, fuente de la papaína. El látex obtenido a partir de frutos inmaduros de C. quercifolia fue recibido en buffer cítrico-citrato de pH 5,6 conteniendo EDTA 5mM y tetrationato de sodio 1 mM, esta preparación fue luego clarificada por centrifugación. El sobrenadante límpido (extracto crudo) mostró una elevada actividad caseinolítica y fue caracterizado por SDS-PAGE e isoelectroenfoque-zimograma revelando la presencia de varias fracciones proteicas básicas proteolíticamente activas. La purificación se llevó a cabo por  cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-100) seguida de intercambio catiónico (SP-Sepharose HR, pH 7,5). La fracción activa más básica que ha sido denominada quercifoliaína I resultó homogénea por isoelectroenfoque-zimograma y SDS-PAGE; se trata de una cisteín-endopeptidasa de pI mayor a 9,3 y peso molecular 24,2 Kda. La hidrólisis de la cadena b de la insulina permitió establecer la especificidad de corte de la enzima: el análisis por MALDI-TOF de los péptidos obtenidos demostró que posee mayor especificidad que papaína, generando sólo 3 escisiones luego de 18 horas de incubación y manteniendo la preferencia por residuos aminoacídicos hidrofóbicos en el subsitio P2. Utilizando herramientas de proteómica (por tratamiento de la nueva enzima con tripsina y posterior análisis de los péptidos por MALDI-TOF MS) se obtuvo el mapa peptídico “fingerprint” de quercifoliaína I que fue comparado con el obtenido para papaína.