Cultivo in vitro de Pseudananas sagenarius (Arruda) Camargo = Pseudananas macrodontes (Morr.) Harm como Fuente de Endopeptidasas

MARTIN M.I., TORRES M.J., PÉREZ MARTÍNEZ A., HERNÁNDEZ M., NATALUCCI C.L. Y MROGINSKI L

La Plata

Congreso; XVI Congreso Latinoamericano de Etnomedicina; 2007

Sociedad Italo-Latinoamericana de Etnomedicina

Plántulas de  Pscudananas sagenarius fueron cultivadas en medio líquido salino MS (Murashige & Skoog). Las proteasas liberadas en el medio de cultivo se compararon con las endopeptidasas presentes en frutos de plantas de la misma especie crecidas a campo. Las condiciones de cultivo de las plántulas germinadas in vitro fueron: temperatura = 25 +/-2 °C; humedad 55%; intensidad de luz 10.000 lux; fotoperíodo = 16:8 horas de luz/oscuridad. El medio de cultivo ensayado para actividad enzimática fue el obtenido luego de 40 días de crecimiento. Los análisis realizados fueron: determinación de grupo catalítico de la enzima empleando inhibidores específicos, actividad coagulante utilizando leche bovina, actividad caseinolítica y determinación de PM y de pI de la fitoproteasa. El empleo de inhibidores específicos de grupo (E-64, PMSF, pepstatinaA, 1,10-fenantrolina) permitió la determinación del grupo catalítico de la proteasa. La actividad coagulante de leche bovina se determinó incubando el medio de cultivo a 37°C durante 5 horas con una solución de leche descremada en polvo preparada en CI2Ca 10 mM conteniendo un agente antimicrobiano (cloruro de benzalconio-clorhexidina). El  resultado positivo demuestra la actividad coagulante debida a la presencia de proteasas en el medio.La actividad caseinoiltica fue determinada utilizando como sustrato caseína al l%.(buffer (Tris-HCl 0,1 M de pH 8,0, con cisteína I2mM como activador). La mezcla de reacción fue incubada a 37ºC y diferentes tiempos (0, 2, 4, 10, 20, 60, 120 y 180 min). La reacción se detuvo mediante el agregado de ácido tricIoroactico al 5% .La actividad fue medida como absorbancia a 280 nm. La actividad proteolítica mostró un aumento lento y lineal a lo largo del tiempo y la actividad fue de 0,003 Ucas/ml de medio. El peso molecular determinado por SDS-PAGE evidencia una banda proteica del valor esperado para endopeptidasas cisteínicas. El pl de la banda activa determinado por IEF, seguido de zimograma, posee un valor cercano a 6. Los resultados obtenidos confirman la presencia de una o más enzimas proteolíticas cisteínicas y un perfil proteico similar al obtenido con los extractivos obtenidos a partir de frutos deP. sagenarius, previamente analizados en nuestro laboratorio.