EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN GLOBAL DE GENES EN YERBA MATE MEDIANTE SECUENCIACIÓN POR NANOPOROS

FAY J.; LITWINIUK S.; KKRYVENKI M; GAUCHAT M; ARGÜELLES C.; FERRERAS J.; MIRETTI M.

Hohenaue

Congreso; VIII congreso sudamericano de yerba mate; 2023

centro yerbatero paraguayo

La transcriptómica se ha convertido en una metodología eficaz para caracterizar y evaluar la actividad de genes en plantas, representando una herramienta fundamental para evaluar la actividad génica en vías metabólicas completas y para comprender la relación entre genotipo y fenotipo. La plataforma de secuenciación MinION (Oxford Nanopore Technologies, ONT) con su pequeño tamaño y bajo costo, representa una poderosa herramienta para la evaluación de la actividad de genes asociados a caracteres de interés en cultivos. El objetivo de este trabajo es evaluar eficiencia y costo de la tecnología de secuenciación por nanoporos para el análisis de la actividad transcripcional en plantas de yerba mate, con el fin de ajustar protocolos, definir procedimientos y escalas para estudios de plantaciones de yerba mate en diversas condiciones experimentales. Con el ARN total obtenido de hojas colectadas de plantas adultas de yerba mate, de la Estación Experimental Agropecuaria del INTA, San Vicente, Misiones se generaron bibliotecas de ADNc a partir de ARNm. Para la síntesis de la primera cadena en longitud completa se utilizó un inhibidor de RNasa, un mix de enzimas con actividad de DNasa bicatenaria y transcriptasa inversa sin actividad H y primers para el cambio de cadena (strand switch). Luego se eliminó el ARN remanente, sintetizó la segunda cadena y procedió con la adición de barcode y adaptadores para secuenciación por nanopores en celdas de flujo MinION (ONT). La secuenciación se extendió por 72hs generando 8.79Gb de cDNA en 4.87millones de lecturas, con un total de 5.32Gbases útiles (modelo “High accuracy basecalling”). Cada una de las 6 bibliotecas cDNA produjo un promedio de 540.400 lecturas de 1,95kb de largo cubriendo entre 10 y 19 veces la región codificante del genoma. Las lecturas más largas sobrepasaron 50kb. El 35% de las lecturas no superó el mínimo de calidad esperado para tecnología ONT (Q-score 9). De la búsqueda preliminar mediante blastX se identificaron genes del metabolismo de plantas (e.g. sistema fotosíntesis, cloroplastídeos, Fenilamonioliasa), utilizando para ello la base de datos curada de proteinas Swiss-Prot, obteniendo una alta identidad a proteínas vegetales (ej. Arabidopsis). En conclusión, la secuenciación en multiplex de bibliotecas derivadas de ARNm de 6 plantas de YM generó información relevante y consistente respecto a la expresión global de genes en plantas de Yerba Mate, con una cobertura adecuada para la evaluación de la actividad génica. Es necesario evaluar la cobertura y representatividad relativa en cada biblioteca, y luego realizar la validación experimental de los datos obtenidos. Estos resultados permitirán escalar el diseño de experimentos para evaluar la expresión génica global en plantas con fenotipos contrastantes o bajo diferentes tratamientos.