Desarrollo de una plataforma para la detección y caracterización de virus transmitidos por Aedes aegypti mediante NGS

RIPOLL, LUCAS; BORIO, CRISTINA; CAROLINA CERRUDO; BILEN, MARCOS

Congreso; SAV 2022; 2022

Asociación Argentina de Microbiologia

Los arbovirus de mayor impacto en la salud, tales como La fiebre amarilla, el Zika, el Dengue y el chikungunya son transmitidos principalmente por mosquitos del género Aedes. Desde la década del 90’ este mosquito ha ampliado significativamente su distribución geográfica llegando hasta el sur de la provincia de Buenos Aires. Actualmente el uso de herramientas basadas en NGS y qPCR ha permitido mejorar la detección de estos virus y profundizar el estudio molecular en relación con su hospedador. En este contexto, es de importancia estudiar el viroma de mosquitos que circulan en Argentina. La información generada puede contribuir a comprender aspectos moleculares de la infección y de la dinámica viral en los principales vectores de enfermedades que afectan la salud humana y animal así como detectar virosis emergentes.El objetivo principal de este trabajo es el desarrollo de una plataforma de secuenciación mediante tecnologías de NGS para la identificación y caracterización de viromas de mosquitos aislados en la República Argentina.La construcción de esta plataforma implica el desarrollo y optimización de cuatro etapas críticas. La extracción del ácido nucléico, la construcción de bibliotecas genómica acordes al sistema de NGS, la secuenciación de las mismas, y el análisis bioinformático.Para la optimización de cada etapa se utilizaron ejemplares adultos de Aedes aegypti cepa Rockefeller de una colonia estable, como ejemplares salvajes. Para la extracción de los ácidos nucleicos se ensayaron diferentes métodos de ruptura y purificación hasta obtener un método ad hoc optimizado. El armado de bibliotecas para NGS implica a su vez, de etapas de retrotranscrición, síntesis de segunda hebra, enriquecimiento mediante PCR, reparación de extremos y ligación de adaptadores que fueron evaluadas y optimizadas con diferentes protocolos. Una vez armadas las bibliotecas se secuenciaron utilizando el sistema MinION Mk1b de ONT. La secuenciación generó 5 x106 reads Luego de la secuenciación se utilizó un pipeline bioinformático para limpiar las secuencias obtenidas y descartar aquellas de baja calidad.Con el set de datos se realizó un ensamblado -de novo- utilizando Canu (v2.1.1) y con los resultados se realizó un BLAST para identificar el las secuencias obtenidas. Los resultados permitieron identificar el genoma utilizado como control interno del proceso y adicionalmente se identificó el genoma correspondiente a un flavivirus específico de insectos llamado Cell fusing agent virus. Por otro lado, se identificaron RNA ribosomal de mosquitos y de bacterias, lo que estaría indicando la necesidad de optimizar alguna de las etapas de extracción de los ácidos nucleicos.Este tipo de plataforma representa una herramienta poderosa que puede ser utilizada para obtener información de la circulación de arbovirus de impacto en la salud humana y animal, para ayudar a la toma de decisiones sanitarias.