Efecto de la ruptura de ooquistes de Eimeria spp. en la identificación de especies mediante PCR múltiple

MARÍA LUZ PISÓN MARTÍNEZ; JESICA D. BRITEZ; ANABEL E. RODRIGUEZ; MARIELA L. TOMAZIC

Jornada; XII Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2023

Facultad de Ciencias Veterinarias UBA

Efecto de la ruptura de ooquistes de Eimeria spp. en la identificación de especies mediante PCR múltiplePisón Martínez María Luz 1, Jesica D. Britez1,2, Anabel E. Rodriguez3, Mariela L. Tomazic1,4 1Instituto de Patobiología Veterinaria (IPVET), INTA-CONICET;2 Cátedra de Parasitología, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires (UBA);3 Instituto de Patobiología, IPVET, INTA-CONICET4 Cátedra de Biotecnología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. UBALa coccidiosis aviar es una parasitosis intestinal causada por especies del género Eimeria,afecta a las aves de corral y es responsable de importantes pérdidas productivas y económicas en todas las escalas de producción avícola.Hasta la actualidad se encuentran identificadas siete especies distintas siendo tres de ellas las más frecuentes: Eimeria acervulina, Eimeria maxima y Eimeria tenella que parasitan el duodeno, yeyuno y ciegos, respectivamente. Siendo E. tenella una especie hemorrágica y una de las más patógenas. Si bien los métodos de diagnóstico tradicionales son muy utilizados y son de vital importancia no permiten diferenciar de forma certera y específica las distintasespecies.A partir de vacunas vivas comerciales con una composición de especies conocida, se buscó evaluar el efecto que posee la ruptura de ooquistes en la especificidad y sensibilidad de la detección molecular con el fin de optimizar la técnica. Las vacunas empleadas fueron V1 con una composición de E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. tenella y E. mitis, V2 con E. acervulina, E. maxima y E. tenella y V3 que posee las 7 especies. A las mismas se les realizaron un primer lavado con agua deionizada estéril y se incubaron con una solución de hipoclorito de sodio 10 minutos a 4ºC. Cada vacuna fue sometida a distintas potencias de ruptura utilizando bolillas de vidrio y el disruptor celular Genie: i. “suave”: 5 ciclos de un minuto a 1.000 rpm y ii. “fuerte”: 6 ciclos de dos minutos a 2.700 rpm. Entre cada uno de los ciclos se colocaron en baño de hielo dos minutos. Posteriormente, se realizó la extracción de ADN utilizando el kit de extracción Wizard (Biorad) y se midió la concentración y calidad del ADN por espectrofotometría (NanoDrop) y electroforesis en geles de agarosa. Luego, se procedió a la identificación de las distintas especies a través de la técnica PCR múltiple donde se evidencian E. acervulina, E. tenella y E. maxima MTX 1 y E. brunetti, E.mitis, E.preacox y E. necatrix en la MTX 2.Para el caso de V1 con ruptura suave no se logra identificar ninguna especie mientras que para la ruptura fuerte, se detectan cualitativamente las cinco especies. Lo mismo ocurre con la ruptura fuerte de V2. En ambos patrones de ruptura se observó degradación del ADN pero no afectó la sensibilidad ni especificidad de la PCR-m.Para evaluar sensibilidad, se realizaron diluciones seriadas del ADN extraído de V2 tanto con la ruptura suave y fuerte. En ambos casos, a medida que el ADN se encuentra más diluido, la sensibilidad de detección de la PCR-m disminuye. Se seleccionó el método de ruptura fuerte y se evaluó la sensibilidad de la vacuna V3, que contiene las 7 especies.En conclusión, implementando ciclos de ruptura fuerte permite una mejor ruptura y mayor extracción de ADN de buena calidad, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad en laPCR-m para detectar las distintas especies. Esto es especialmente importante en muestras con una baja cantidad de ooquistes . Con respecto a la especificidad, no encontramos variaciones entre ambos ciclos de ruptura y la detección de especies esperadas.