Enzimas inmovilizadas del veneno de cascabel para la producción de lisolecitinas

MARIA DEL ROSARIO ALONSO; LUCIANO FUSCO; LAURA LEIVA

Corrientes

Jornada; XXVII Comunicaciones Cientificas y Tecnologicas de la Universidad Nacional del Nordeste; 2022

Las enzimas son catalizadores producidos por los seres vivos, altamente efectivas y se requieren en muy bajas concentraciones. Estas características las vuelve adecuadas para su uso en aplicaciones industriales, alimenticia, cosmética y farmacéutica, entre otras. En el NEA habitan especies que resultan de interés por ofrecer una secreción rica en enzimas que pueden tener aplicabilidad industrial, tal el caso particular de las serpientes venenosas, donde la extracción del veneno es un procedimiento inocuo para el animal, que no implica su sacrificio.La serpiente de cascabel (Crotalus durissus terrificus), ampliamente distribuida en centro y norte de Argentina, se caracteriza por presentar en su veneno un alto contenido de fosfolipasas A2.Estas enzima actúan sobre los glicerofosfolípidos, hidrolizando el ácido graso de la posición 2 del glicerol, liberando lisofosfolípidos. Estas moléculas, son excelentes emulsionantes y surfactantes adecuados para su uso en muchas aplicaciones industriales, como la tecnología alimentaria, especialmente las lisolecitinas.A partir de estos antecedentes y teniendo en cuenta que los catalizadores deben permanecer en el medio de reacción cuando los productos de la catálisis son retirados, en el presente trabajo se llevó a cabo el aislamiento e inmovilización de PLA2 del veneno de la serpiente cascabel, con el fin de evaluar su actividad catalítica sobre una fuente rica en lecitinas para la obtención de lisolecitinas.La fosfolipasa A2 (PLA2) fue purificada por cromatografía de exculsión molecular sobre sephadex G-75 a pH1,9 recolectando las fracciones que presentaron actividad fosfolipásica ( medida por test de hemólisis radial indirecta, HRI). La PLA2 fue inmovilizada en SP sephadex C-25 a Tamb, bajo agitación magnética suave durante 24h. La cantidad de enzima retenida se evaluó por  Abs UV (280nm) y por HRI. Los extractos de lecitinas (ELs) se obtuvieron a partir de yema de huevo (20 g) mediante extracciones con disolvente: primera etapa con etanol (96%), y luego la fracción soluble se trató con acetona; finalmente, el precipitado se secó en estufa a 37ºC. Las lecitinas presentes en el ELs se detectaron mediante dos ensayos: a) precipitación con solución saturada de cloruro de cadmio 2% en etanol, y b) por movilidad relativa en cromatografía en capa delgada (TLC), sobre gel de sílice 60 F254 utilizando éter de petróleo/éter etílico/ ácido acético ( 90:10:1 v/v/v) y cloroformo/ metanol/ agua (65:35:3 v/v/v) como fases móviles. Se reveló con reactivo de Dragendorff. Para la obtención de lisolecitinas se incubó bajo sistema batch los ELs con la PLA2 inmovilizada SP sephadex C-25.Los lisofosfolípidos presentes en el sobrenadante se detectaron mediante TLC. Las manchas obtenidas se analizaron por densitometría (software ImageJ), y a partir de las áreas de cada pico se estimó el contenido porcentual relativo de lecitinas y lisolecitinas presentes en las diferentes muestras.Los resultados mostraron que, el tratamiento con etanol (96%) seguido de extracción con acetona fue apropiado para obtener un sólido de color ámbar y aspecto ceroso, que en solución etanólica mostró reacción positiva para lecitinas con solución saturada de cloruro de cadmio (2%)y a la vez presentó una posición relativa compatible con fosfolípidos cuando se reveló con reactivo de Dragendorff en la TLC. Se logró inmovilizar un 53% del contenido proteico presente en la solución inicial del veneno.El análisis por TLC del sobrenadante obtenido luego de la hidrólisis permitió comprobar la presencia de lisolecitinas resultantes de la catálisis llevada a cabo por la enzima inmovilizada sobre ELs. Los resultados de este estudio preliminar ponen en evidencia que las 3 muestras contienen lisolecitinas, están presentes en la yema de huevo (23,9%), en el extracto de lecitinas (28 %), sin embargo, el tratamiento con la PLA2 inmovilizada elevó en un 15 % el contenido en este tipo de lípidos con respecto a la muestra inicial. Esta matriz con PLA2 inmovilizada se presenta como una candidata atractiva para el proceso de obtención de lisolecitinas, sólo se requieren ajustes cinéticos (control del pH, temperatura, tiempo) para elevar la hidrólisis a un 100% de las lecitinas iniciales.