Determinación simultánea de múltiples fitohormonas por LC-MS/MS: su aplicación en el estudio de la germinación y dormición de semillas de girasol

SERGIO G. ALEMANO; ANA E. VIGLIOCCO; ANDREA M. ANDRADE

Congreso; III Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2016

Las fitohormonas regulan diversos procesos fisiológicos de las plantas, entre ellos germinación, crecimiento y reproducción; como así también están involucradas en las respuestas de defensa a factores de estrés biótico y abiótico. Es ampliamente conocido que ácido abscísico (ABA) y giberelinas (GAs) desempeñan un rol antagónico en la regulación de la germinación y dormición de semillas (1). No obstante, diferentes estudios han demostrado que otras fitohormonas tales como ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (SA) y auxinas también están involucradas en dichos procesos (2). En este sentido, es relevante poder cuantificar las hormonas en los tejidos que constituyen la semilla a fin de comprender el complejo ?cross-talk? hormonal que regula sinérgica y/o antagónicamente los procesos de germinación y dormición. El desarrollo de un método analítico altamente sensible para cuantificar diferentes fitohormonas en forma simultánea facilitará la comprensión de su interacción en dichos proceso. En particular las semillas de girasol tienen un alto contenido de materia grasa, lo cual dificulta la extracción y cuantificación de fitohormonas. Por lo tanto, el propósito de este trabajo fue desarrollar un método de extracción y purificación reproducible y estable que permitiera, junto al empleo de un Cromatógrafo Líquido (Alliance 2695; Waters, Inc., California, USA) acoplado a un Espectrómetro de Masa de triple cuadrupolo (Micromass Quatro UltimatmPT, UK), la cuantificación simultánea de fitohormonas en embriones de girasol. Para la extracción y purificación de ácido jasmónico (JA), ácido salicílico (SA) y ácido indol-3-acético (AIA) se utilizó el método de Durgbanshi et al. (3) con modificaciones, el cual se fundamenta en una doble partición líquido-líquido con éter etílico. La cuantificación hormonal se realizó mediante el empleo de estándares internos deuterados añadidos al momento de la extracción, y luego mediante el empleo de curvas de calibración. Tal metodología utilizada permite la corrección de eventuales pérdidas que pudieron ocurrir durante el proceso de extracción (4). La adquisición de datos se efectuó en modo MRM (Monitoreo de Reacciones Múltiples) utilizando las siguientes transiciones: JA (m/z 209/59), D6-JA (m/z 215/59), SA (m/z 137/93), D3-SA (m/z 141/97), AIA (m/z 174/130) y D5-AIA (m/z 180/135). El software utilizado fue Masslynk v. 4.1 Se realizó la cuantificación simultánea de JA, SA y AIA en embriones de semillas de girasol secas y embebidas de las líneas B123 (con dormición a cosecha) y B91 (sin dormición a cosecha), permitiendo una remoción eficiente de los lípidos. SA presentó mayores niveles endógenos en embriones de semillas secas y embebidas de ambas líneas tanto al momento de cosecha como posterior al almacenaje a 25°C durante 33 días. Referencias:1- Lee, H.G.; Lee, K.; Seo, P.J. Plant Mol. Biol. 2015, 87, 371-381.2- Shu, K.; Liu, X.-D.; Xie, Q.; He, Z.-H. Mol. Plant. 2016, 9, 34-45. 3- Durgbanshi, A.; Arbona, V.; Pozo, O.; Miersch, O.; Sancho, J.V.; Gómez-Cadenas, A. J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 8437-8442.4- 4-Xiaoqiang, C.; Hua, F.; Xuedong, P.; Xiao, W.; Min, S.; Bo, F.; Yunlong, Y.J. Environ. Sci. 2008, 20, 464-469.