Extracción, purificación y cuantificación simultánea de fitohormonas en girasol por LC-MS/MS

ALEMANO, SERGIO; VIGLIOCCO, ANA; ANDRADE, ANDREA

Congreso; II Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2014

Numerosos estudios han sido llevados a cabo para determinar niveles endógenos de hormonas vegetales. La mayoría de ellos se han focalizado en el análisis de un solo compuesto, o unas pocas clases de fitohormonas (Lopez-Carbonell y Jauegui, 2005). Sin embargo, la disponibilidad de un método sensible y simple para cuantificar en forma simultánea múltiples fitohormonas es una herramienta útil para el estudio de sus interacciones y funciones biológicas. Del mismo modo, previo a la identificación y cuantificación, aún existe la necesidad de disponer de métodos de extracción y purificación convenientes y eficientes. Al respecto, son escasos los análisis de comparación o validación cruzada de métodos de extracción, existiendo relativamente pocos que permiten extraer con igual eficiencia todas las clases hormonales (Pan y Wang, 2009). Por lo tanto, el propósito del presente trabajo fue comparar tres métodos de extracción y purificación, a fin de seleccionar aquel más reproducible y estable que permitiera, junto a un Cromatógrafo Líquido (Alliance 2695; Waters, Inc., California, USA) acoplado a un Espectrómetro de Masa de doble cuadrupolo (Micromass Quatro UltimatmPT, Manchester City, UK), la cuantificación simultánea de fitohormonas en semillas de girasol. Para ello, se ensayaron tres métodos. El método de Chiwocha et al. (2003) se basa en una extracción en fase sólida empleando columnas Sep-Pak C18, para separar compuestos polares y no polares. Durgbanshi et al. (2005) se fundamenta en una doble partición líquido-líquido usando éter etílico. El tercer método emplea una columna de fase reversa LiChrolut PR-18. Estos métodos fueron utilizados para extraer y purificar ácido abscísico (ABA), ácido faseico (PA), ABA-glucosil éster (ABA-GE), giberelinas (GA1 y GA3), ácido jasmónico (JA), ácido salicílico (SA) y ácido indol-3- acético (AIA). La cuantificación de las hormonas se realizó mediante el empleo de estándares internos deuterados añadidos al momento de la extracción, y luego por el uso de curvas de calibración. La adquisición de datos se efectuó en modo MRM (Monitoreo de Reacciones Múltiples). Se realizó un monitoreo de iones parentales y transiciones tanto de las hormonas puras como de sus respectivos estándares. El software utilizado fue Masslynk v. 4.1 (Micromass, UK). El método del estándar interno permitió la corrección de eventuales pérdidas que pudieron ocurrir durante la extracción de la muestra (Xiaoqiang et al., 2008). Se demostró que la técnica de Durgbanshi et al. (2005) resultó la adecuada según los requerimientos del trabajo, debido a que una partición líquido-líquido fue más apropiada para purificar en forma simultánea las fitohormonas de interés, al tiempo que permitió una remoción más eficiente de lípidos, hecho que mejora la sensibilidad de la técnica principalmente en semillas de girasol donde se alcanzan valores de hasta el 50 % de materia grasa.