Estudio de los cambios conformacionales en la región transmembrana de la PMCA mediante una sonda fosfolipídica

IRENE MANGIALAVORI; ANA VILLAMIL GIRALDO; MARIELA FERREIRA GOMES; M. FLORENCIA PIGNATARO; EMANUEL E. STREHLER; JUAN PABLO ROSSI

Córdoba

Congreso; XXXVII. Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2009

Sociedad Argentina de Biofísica

El propósito de este trabajo fue obtener información estructural sobre los cambios conformacionales de la bomba de Calcio de Membrana Plasmática (PMCA) producidos por la unión de Ca2+, calmodulina y fosfolípidos ácidos. Hemos demostrado [1] que los cambios conformacionales en la región citoplasmática son acompañados por cambios en la región transmembrana de la enzima. La incorporación específica de [125I]TID-PC/16, un análogo de fosfatidilcolina fotoactivable, permite estudiar la interfase lípido-proteína [2] y nos permitió demostrar la existencia de una conformación inhibida en presencia de Ca2+ (E1I) y una conformación activada (E1A) en presencia de Ca2+ y calmodulina o tratamientos que simulan los efectos de calmodulina [1].  En este trabajo utilizando esta sonda, determinamos las constantes de disociación (kD) para Ca2+, calmodulina, ácido fosfatídico y ácido oleico. Por otra parte, la proteólisis parcial de PMCA con proteasa V8, permitió identificar las regiones transmembrana que sufren cambios conformacionales. Nuestros resultados indican que: (a) La modulación de la enzima es ejercida a través del dominio C-Terminal, que induce una conformación auto-inhibida aparente para el transporte pero no modifica la afinidad por Ca2+  del dominio transmembrana. (b) La unión de calmodulina provoca una menor incorporación específica de [125I]TID-PC/16 en la región C-Terminal (TM 5-10) y Central (TM 3-4) mientras que en la activación por ácido fosfatídico, se observan cambios en la región Central (TM 3-4) y N-Terminal (TM 1-2) de la proteína, sugiriendo que estos moduladores presentan un mecanismo diferente de activación.  En conclusión mostramos que la activación por fosfolípidos ácidos o calmodulina se produce por modificación de distintas zonas citoplasmáticas lo que indicaría la existencia de más de una conformación activada (E1A) y que la unión de Ca2+ en el equilibrio no se modifica por la presencia de los activadores, aunque disminuya la constante de afinidad aparente determinada por la actividad ATPasa [3]. Con subsidios ANPCYT, CONICET, UBACYT y NIH.   [1] Mangialavori, I.C. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284, 4823-4828 [2] Villamil Giraldo A.M et al. FEBS (2006).  580, 607-612. [3] Mangialavori, I.C. et al. (2009) J. Biol. Chem. enviado