Optimización de la técnica de pcr para la detección de los SNPs rs2305767 y rs1457092 del gen MYO9B asociados a la enfermedad celíaca.

LÓPEZ, MIRYAN SUSANA; TISCORNIA, MARÍA MERCEDES; ROSAS, ROCIO AYELEN

Posadas

Jornada; Jornada Científico-tecnológico; 2018

Universidad Nacional de Misiones

Introducción :El gen MYO9B codifica a la proteína Miosina IX B que está implicada en el remodelamiento de la barrera intestinal. Se cree que una variante genética codificada por el gen MYO9B puede llevar a una alteración en la barrera intestinal, lo que permite el paso de péptidos inmunogénicos de gluten e inicia la respuesta inflamatoria. En algunas poblaciones se encontraron asociaciones entre la EC y las variantes alélicas rs2305767 y rs1457092 del gen MYO9B.Objetivos?Diseñar cebadores que permitan la amplificación de las regiones genómicas que contenga los polimorfismos asociados a la enfermedad celiaca rs2305767 y rs1457092 en el gen MYO9B.?Optimizar las condiciones de la técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) para los cebadores diseñados.Materiales y Métodos: Las extracciones de ADN se realizaron por el método Salting-Out modificado. Los cebadores para las regiones intronicas del gen MYO9B que contengan los polimorfismos rs2305767 y rs1457092 fueron diseñados mediante el programa bioinformático Primer3 a partir de las secuencias de referencia contenida en la base de datos GenBank en el NCBI (National Center for Biotechnology Information). Se identificó el gen MYO9B en el NCBI como NG_013068.1, en el cromosoma 19. Se tuvo en cuenta para el diseño de los cebadores: la longitud de los cebadores (18 ? 24 pb), el contenido de G:C entre 40-60 % y la diferencia de temperaturas de hibridación entre los cebadores menor a 5 °C. Para la optimización de la PCR se modificó la concentración de ClMg2, la temperatura de Hibridación (Tm) y las condiciones de ciclado. Los amplicones obtenidos se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 % (p/v) en buffer TE, teñidos con GelRed, se compararon con un marcador de peso molecular 1000pb. Las secuencias obtenidas se verificaron mediante el programa Chromas. Resultados:Los cebadores diseñados con Primer3 fueron: para el polimorfismos rs2305767: cebador sentido 5?-3? CTACCAGCACATGGCAAAGA y cebador antisentido 5´?-3? CTGGCGGGTTAGACTGAGAG y para el polimorfismo rs1457092 cebador sentido 5?-3? CACTCACCAAATTGCTGCCC y cebador antisentido 5´-3? GCGATCTTCCCATCTAGGCC. Para el SNP rs2305767 se logró la optimización de la PCR con las siguientes condiciones: 2,5 mM de MgCl2, 0,5 µM de cada cebador y una Th de 58°C obteniéndose un amplicón de 391 pb. Mientras que para el SNP rs1457092 las condiciones fueron: 2 mM de MgCl2, 0,5 µM de cada cebador y una Th de 66°C y el amplicón que se obtuvo fue de 545 pb. El programa de ciclado aplicado fue: desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min, 30 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a Th correspondiente a cada amplicón y 30 s a 72°C, extensión final a 72°C durante 5 min. Fuero verificados los genotipos C/T, T/T y C/C del SNP rs 235767 y los genotipos C/A , A/A y C/C del SNP rs1457092.Conclusión:La puesta a punto de la am¬plificación de un segmento del gen MYO9B pudo emplearse para la identificación de secuencias asociadas a la enfermedad celíaca