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Introducción La Expansión de Diversidad Molecular de colecciones naturales es una estrategia consistente en reciclar extractos naturales utilizándolos como sustrato para la preparación de extractos modificados ó colecciones hijas, por modificación química de la colección madre original. Su implementación requiere del desarrollo de reacciones apropiadas capaces de modificar una porción significativa de los componentes presentes. Uno de los grupos funcionales presentes en mayor proporción en productos naturales es el grupo carbonilo,[1] modificable por ataque con reactivos nucleofílicos tales como hidracina (NH2-NH2), un nucleófilo que no se encuentra comúnmente formando parte de metabolitos secundarios de plantas superiores. Esta reacción tiene la propiedad de aumentar la proporción de nitrógeno, un parámetro cuyo valor es bajo en poblaciones de estructuras de origen natural con respecto a los encontrados en estructuras activas (drogas).[2],[3] Previamente demostramos la factibilidad de generar actividad antifúngica a partir de un extracto inactivo de Polygonum ferrugineum por reacción con hidracina.[4] En este trabajo se presenta la modificación química con hidracina de extractos provenientes de otras especies vegetales, con alteración tanto de la composición química como de su actividad antifúngica. Metodología Material Vegetal Se trabajó con partes aéreas Gochnatia glutinosa (D. Don) Hook et Arn. y de Zuccagnia punctata Cav. Preparación de los extractos Las partes usadas molidas fueron extraídas por maceración con agitación mecánica (3 x 24 hs.) utilizando metanol o etanol como solvente extractivo. El material vegetal fue separado por filtración con vacío y los extractos fueron concentrados a presión reducida hasta sequedad. Modificación de extractos naturales A 100 mg de extracto (aproximadamente 0.33 mmoles)[5] disueltos en 5 ml de EtOH se le agregaron 50 mg de hidracina monohidrato (1 mmol) disueltos en 0,05 ml de EtOH. La solución se agitó a reflujo durante 7 horas en baño de glicerina y posteriormente se eliminó el solvente a presión reducida. El crudo se disolvió en DCM (7 ml) y la solución resultante se lavó con agua (2 X 5 ml.). La solución DCM se secó (Na2SO4) y concentró a presión reducida. Análisis de cambios producidos La comparación de los perfiles de composición química de los extractos con sus correspondientes productos pos-reacción fue realizada por cromatografía en capa delgada CCD y por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas previa derivatización con agente sililante(CG-EM). El análisis de actividad se realizó a través de bioautografía en capa de agar utilizando las levaduras Cryptococcus neoformans y Candida albicans, con MTT y rojo fenol como reactivos reveladores de desarrollo fúngico.[6] Resultados Cambios observados en la composición química de los extractos Fueron detectados cambios en los perfiles de desarrollo cromatográfico en CCD utilizando UV como revelador tanto para G. glutinosa (Fig. 1) como para Z. punctata (Fig. 2). Tales modificaciones también fueron observadas al analizar los cromatogramas gaseosos correspondientes, donde se ve aparición y desaparición de picos como consecuencia de la reacción en ambos extractos modificados. 365 nm Visible 254 nm CG-EM E1 E2 E1 E2 E1 E2 Figura 1: Perfiles cromatográficos en CCD y CG-EM del extracto EtOH de G. glutinosa modificado con hidracina y sin modificar. Nota: E1: Extracto EtOH de G. glutinosa (línea verde). E2: lavado DCM de reacción con 0,5 mg hidracina/mg extracto (línea roja). Figura 2: Perfiles cromatográficos en CCD y CG-EM del extracto extracto EtOH de Z. punctata modificado con hidracina y sin modificar. E3 E4 365 nm Visible 254 nm CG-EM E3 E4 E3 E4 Nota: E3: Extracto EtOH de Z. punctata (línea roja). E4: lavado DCM de reacción con 0,5 mg hidracina/mg extracto (línea lila). Efectos sobre la actividad antifúngica de los extractos Tabla 1: Cuadro comparativo de las variaciones en la actividad antifúngica de los extractos de Z. punctata y G. glutinosa antes y después de su reacción con hidracina. Extracto Actividad pre-modificación Actividad post-modificación Cambios en la actividad G. glutinosa Activo Activo aparente cambio del/los compuesto/s responsables de la actividad Z. punctata Activo Inactivo desaparición de los compuestos activos La modificación del extracto de G. glutinosa produjo cambios en las relaciones de frente (Rf) de los halos de inhibición existentes. Z. punctata perdió la actividad que presentaba antes de ser modificado, esto indica que mediante reacciones químicas es posible cambiar el patrón de actividad de un extracto vegetal, aunque la pérdida de actividad sería un efecto adverso. Conclusiones La modificación de grupos carbonilos por reacción con hidracina provocó la modificación del perfil de desarrollo cromatográfico en los dos extractos incluidos en este estudio. La actividad antifúngica fue drásticamente alterada como consecuencia de la reacción. Este resultado ilustra el potencial de la EDM en la generación de mezclas de compuestos con propiedades biológicas diferentes de las de los extractos naturales que le dieron origen. Referencias [1] Ramallo, I.A. (2005). Tesina para optar al grado de Licenciado en Biotecnología, UNR, p. 49. [2] Henkel T.; Brunne, R.; Müller, H.; Reichel, F. (1999). Angew. Chem. Int. Ed. 38, No. 5, 643-. [3] Feher, M., Shmidt, J.M. (2003) J. Chem. Inf. Comput. Sci., 43, 218. [4] López, S.N.; Ramallo A., González Sierra, M.; Zacchino, S.A.; Furlán, R.L.E. Póster, V Reunión de la Soc. Latinoamericana de Fitoqca. Montevideo, Uruguay, 28/11 al 02/12/2005. [5] Lee. M-L, Schneider, G. J. Comb. Chem. 2001, 3, 284-. [6] Saxena, G. et al. 1995 Phytochem. Anal. 6, 125

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