Obtención de exoproteínas de importancia industrial a partir de cepas de Staphylococcus aureus. Su rol como agentes terapéuticos de la mastitis bovina.

PELLEGRINO, M.; GALETTO, M.; WILL, I.; BOGNI, C.

Río Cuarto

Seminario; Seminario Académico Científico de Grado; 2003

Secretaría de Ciencia y Técnica de la Univ. Nacional de Río Cuarto

Las proteasas microbianas están entre las enzimas hidrolíticas más importantes, constituyen aproximadamente el 60% del mercado industrial de enzimas. Numerosos microorganismos como bacterias y hongos producen elevados niveles de proteasas que son utilizadas exitosamente en la elaboración de detergentes enzimáticos, medicamentos, alimentos, curtiembres y tratamiento de deshechos industriales. Staphylococcus aureus sintetiza numerosas exoproteínas (toxinas, enzimas hidrolíticas, etc.), consideradas factores de virulencia, elaboradas como parte de sus mecanismos para invadir al huésped y provocar infección. En el laboratorio de Genética Microbiana de la UNRC se aislaron y caracterizaron mutantes insercionales, que exhiben alteraciones en la producción de varias exoproteínas, en particular proteasas en distintas condiciones de cultivo. La mutante RC128 evidenció una marcada actividad de proteasas tanto en condiciones in vitro como in vivo. En este contexto surge el interés por el estudio de las enzimas con actividad proteolítica producidas por S. aureus y su posible aplicación en el área industrial. El objetivo general de este trabajo fue abordar el estudio de las exoproteínas producidas por cepas de S.aureus y su posible aplicación en el área industrial. Los resultados obtenidos indicaron que la mutante RC128 muestró una actividad aumentada respecto de la cepa parental RC108 en todos los medios de cultivo ensayados. Se detectaron tres bandas con actividad proteolitica de 35 KDa(I), 29.KDa (II) y < 20 KDa (III). La banda I pudo ser observada en todos los medios probados para la cepa mutante RC128, mientras que para la cepa salvaje RC108 solamente se observó en D, D2, AL, AS y BHIA L. La banda II fue de mayor concentración que las otras bandas para la cepa mutante y se observó en D, D1, AL, BHIA ,BHI, BHIA L , mientras que para la cepa salvaje solo se evidenció en D y BHIA L. La banda III solo se observó en los medios D y BHIA L únicamente para la cepa mutante sugiriendo que algún componente del medio, inhibe la actividad proteolítica de esta enzima. La mayor concentración de la banda II se evidenció en los medios BHIA y D. La producción de proteasas resultó ser mayor cuando los sobrenadantes provenían de cultivos crecidos sobre membranas de diálisis colocada en la superficie de medios agarizados. Por siembra en placas de agar caseína suplementado con distintas sales se pudo determinar un halo de precipitación mayor para la cepa mutante respecto de la salvaje excepto para AC+ 10mM EDTA donde no se observó crecimiento ni producción de proteasa en ninguna de las dos cepas. Concentraciones de 1mM MgCl2 y 1mM CoCl afectan marcadamente la actividad proteolítica mostrando un halo disminuído de precipitación de la caseina. Se continuará con la determinación de las condiciones óptimas de pH y temperatura de crecimiento y producción de proteasa en los medios seleccionados. Se determinó además, la producción de exoproteínas con actividad antimicrobiana con potencial uso para el control de la mastitis bovina. Se analizaron 23 cepas de S. aureus por el método de siembra en placas de agar conteniendo una cepa de S. aureus como indicadora. De las 23 cepas analizadas, 11 inhibieron el crecimiento de la cepa indicadora S. aureus 1631A, produciendo diferentes diámetros en el halo de inhibición. Cuatro produjeron inhibición a los 5 días (H39, H40, H43, H48), mientras que las 8 restantes (H13, H27, H33, H41, H45, H50, H55) a los 7 días de incubación. Se prevee realizar modificaciones al método como la utilización de soft-agar (0.8%) para la inclusión del microorganismo indicador lo cual permitirá una mejor difusión de los sobrenadantes como así también el uso de cepas indicadoras con mayor sensibilidad a la inhibición como Corynebacterium fimi (NCTC7547) en lugar de S.aureus