Desarrollo de un ELISA competitivo indirecto multiespecie para la detección de anticuerpos totales contra el virus de la hepatitis E

ARCE LORENA PAOLA; MARIA FLORENCIA PAVAN; MARINA BOK; VIVIANA PARREÑO; MARIA GUADALUPE VIZOSO-PINTO; LORENA ITATÍ IBAÑEZ

CORDOBA

Jornada; REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL SAV 2022; 2022

SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGIA 2022

El virus de la hepatitis E (HEV) es un virus zoonótico y emergente causante de hepatitis aguda.La serología para el HEV es de gran importancia tanto en estudios epidemiológicos como paracontrolar la transmisión de la enfermedad. Recientemente, obtuvimos nanoanticuerpos(VHHs) contra la proteína de cápside (ORF2) del HEV genotipo 3 (HEV-3) para desarrollar unELISA competitivo (cELISA) que permita detectar inmunoglobulinas totales (Ig) de distintasespecies animales.ORF2 HEV-3 fue expresada y purificada usando la resina NiNTA. Después de inmunizar unallama con ORF2 soluble, se construyó una librería de VHHs y se seleccionaron los VHHsespecíficos para ORF2 mediante la técnica de <pannig> con <display> de fago. Los VHHs anti-ORF2 fueron expresados en <E. coli> TG1, evaluados por ELISA indirecto y los clones positivosenviados a secuenciar. Se expresaron y purificaron VHHs anti-ORF2 seleccionados según laregión hipervariable determinante de complementariedad 3 (CDR3). Se puso a punto el cELISAconsiderando: concentraciones de ORF2 y de VHHs, agentes bloqueantes, dilución de suero yde Ac secundario (anti-HisHRP). Para la validación del cELISA (<cut-off>, sensibilidad,especificidad, AUC, grado de concordancia, precisión y límite de detección) se empleó un panelde sueros caracterizados con el kit DIAPRO. Finalmente, se analizaron 62 muestras depacientes con hepatopatías y sueros de diferentes animales: cerdo, jabalí, ciervo y ratón.De los 6 VHHs anti-ORF2, se seleccionó el VHH11 y se establecieron las siguientes condicionespara el cELISA: ORF2 HEV-3 0,05 g/ml, VHH11 60 ng/ml, suero sin diluir, leche 5% (agentebloqueante) y dilución del Ac conjugado 1/10000. Mediante análisis ROC (CaracterísticaOperativa del Receptor) calculamos una sensibilidad de 97,4 %, especificidad 95,8 %, <cut off>de 69,16% y buena capacidad discriminativa debido a su AUC (área debajo de la curva) de0,976. La variabilidad intra e interensayo calculado mediante el coeficiente de variación (CV)fue < 10% y <15%, respectivamente, lo que indicó que el inmunoensayo es preciso. El índice<kappa> fue de 0,93 indicando un buen grado de concordancia con respecto al kit comercial;aunque su límite de detección fue menor que el kit DIAPRO. Con el cELISA se determinó unaseroprevalencia de 8% en pacientes con hepatopatías (5/62). También fue posible diferenciarmuestras seropositivas y negativas en todos los animales testeados.Reportamos por primera vez la aplicación de VHHs contra el HEV-3 en un inmunoensayo ydesarrollamos un cELISA multiespecie para detectar Ig anti-HEV-3 que puede ser usado tantoen humanos con fines epidemiológicos como en el ámbito veterinario para prevenir y controlarla transmisión zoonótica por el HEV-3.