Prototype of a nanobodies-based Sandwich ELISA for the detection of Hepatitis E Virus antigen of zoonotic transmission

ARCE LORENA PAOLA; JULIA MATIAS BRANCHER; MARIA FLORENCIA PAVAN; MARINA BOK; VIVIANA PARREÑO; MARIA GUADALUPE VIZOSO-PINTO; LORENA ITATÍ IBAÑEZ

Tandil

Jornada; XIII Jornadas de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria I Reunión de la Red Latinoamericana de Inmunología Veterinaria; 2022

El Virus de la Hepatitis E (HEV) es un virus zoonótico emergente causante de hepatitisaguda. La detección del antígeno de cápside (ORF2 glicosilada) que circula libre enplasma o de la partícula viral en heces permite diagnosticar la infección.Recientemente, obtuvimos nanoanticuerpos (VHHs) contra ORF2. Nuestro objetivo fuedesarrollar un prototipo de inmunoensayo basado en VHHs para la detección deantígeno.ORF2 HEV-3 fue expresada en células HEK 293 y purificada mediante cromatografíade afinidad. Se seleccionaron 6 VHHs anti-ORF2 según la región determinante dehipercomplementariedad (CDR3) y se realizó la expresión, purificación y modificacióncon diferentes etiquetas (unión a plástico (VHHPSW) y unión a biotina (VHHbio)). Laafinidad de los VHHs sin modificar se evaluó mediante ELISA indirecto, brevemente sesensibilizó con diferentes concentraciones de ORF2 (o.n. 4°C), bloqueo con leche 5%,luego se añadió diferentes concentraciones de VHHs y finalmente se incubó con anti-HisHRP. Los VHHs con y sin modificaciones que presentaron mayor afinidad por laproteína, se usaron para un prototipo de ELISA sándwich para la detección deantígeno. Se probaron: tipo de placa y concentraciones variables de los siguientesreactivos: VHH, VHHPSW, agente bloqueante, ORF2 glicosilada, VHHbio y anticuerpoestreptavidina HRP.Los VHHs que presentaron mayor afinidad fueron los VHH11 y VHH18. Lascondiciones preliminares para el ELISA sándwich fueron: concentración del VHHPSW0,1 g/ml, gelatina 1%, VHHbio 1/200 y estreptavidina conjugada 1/10000. El límite dedetección fue 100 ng/ml de ORF2 glicosilada.Desarrollamos un prototipo para detección de antígeno de HEV que luego de servalidado podrá ser usado en muestras de suero y heces para el diagnóstico ypronóstico de la infección por HEV. Esta herramienta es de utilidad para el control dela transmisión zoonótica del HEV-3.